DMIs杀真菌剂结合光谱筛选法的建立和应用

论文摘要

结合光谱法已经被用于杀真菌药物筛选和分子相互作用的分析，但由于真菌CYP51（羊毛甾醇14α-去甲基化酶）是膜结合蛋白，较难纯化得到足够量且有活性的靶酶，所以在研究中通常采用纯化的可溶性原核CYP51蛋白，这种做法不可避免会造成误差。因此建立一种快捷和准确的方法用于靶酶CYP51的杀真菌剂的筛选，对大量筛选新型合成药物具有重要的意义。运用此方法可以分析杀真菌剂和靶酶CYP51的结合能力，筛选潜在有应用价值的新型杀真菌剂，并为优化设计合成高效、低毒、高选择性的DMIs杀真菌剂化合物提供了重要依据。以稻瘟菌微粒体和异源表达的稻瘟菌CYP51为材料，分析了以市售烯唑醇、戊唑醇、三唑醇和三唑酮为代表DMIs类杀真菌剂与CYP51的结合能力，分析了靶酶活性、靶酶纯度和靶酶浓度对二者结合光谱的影响，并与生物测试结果比较分析其可靠性。结果表明靶酶的活性、无其它P450干扰和合适的靶酶浓度是获得准确结合光谱的必要条件。烯唑醇、戊唑醇、三唑醇、三唑酮与靶酶结合常数（Kd）分别为0.143μM、0.24μM、0.257μM、0.307μM，该结果与其对稻瘟菌生长抑制能力(120h-EC50)显著相关，证明光谱法可作为一种简便可靠的DMIs类杀真菌剂筛选方法。以E. coli表达CYP51为材料，研究不同结构的药物与CYP51的结合能力，结果表明：含吲哚环类药物EVE-2、EVE-3及LHEXP-10、LHEXP-3s均和CYP51结合，结合常数分别为73.039μM、18.634μM、2.18μM、66.998μM；三唑并咪唑啉酮类药物FBQbp-25与CYP51结合，Kd值为1.607μM，FBQbp-57与CYP51不结合；咪唑啉酮类药物中的SYL-25、SYL-35、SYL-36、DM-2、SC-11均与CYP51紧密结合，Kd值分别为5.147μM、8.653μM、10.199μM、3.603μM和3.795μM，而SYL-27、DM-5、SC-17、SYC-4与CYP51的完全不结合，SYL-26、SYL-33、SYC-11和ZD-6与CYP51有部分结合，但结合特异性较低。通过研究还发现部分药物与CYP51的结合能力，与它们对稻瘟菌生长抑制实验的结果不相符合。同类型的药物在基本结构相同的情况下，取代基的数量、位置及种类的不同，使它们与CYP51的结合能力也不同。19种药物筛选结果，其中EVE-3、LHEXP-10、FBQbo-25、SYL-25、SYL-35、SYL-36、DM-2、SC-11具有杀菌潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 14α-去甲基化酶概述
• 1.1 CYP51（Sterol 14α-demethylases,P45014DM）的概念
• 1.2 CYP51的分布及底物类型
• 1.3 CYP51的功能
• 1.4 CYP51的结构
• 2 CYP51与抗真菌研究现状
• 2.1 抗真菌药物的的类型
• 2.2 14α-去甲基酶抑制剂（DMIs）的抑菌机制
• 2.3 氮唑类抑制剂的抗真菌研究进展
• 3 DMIs药物对靶酶CYP51作用的方法学研究
• d'>3.1 结合光谱法分析K_d
• 3.2 高效液相色谱法（HPLC）
• 3.3 气-质联用法GC/MS（gas chromatography-mass spectrometry）
• 3.4 同位素掺入法
• 3.5 薄层色谱（TLC）扫描法
• 3.6 DMIs药物对靶酶CYP51作用的方法的比较
• 4 结合光谱法分析原理及分析方法
• 5 本文的研究目的、内容及研究意义
• 第二章 异源表达CYP51结合光谱的光谱法的建立
• 1 材料和仪器
• 1.1 菌种及质粒
• 1.2 药物及试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 药物对稻瘟菌生长抑制的测试方法
• 2.2 稻瘟菌微粒体的制备
• 2.3 微粒体的鉴定:葡萄糖-6-磷酸酶显示反应
• 2.4 异源表达稻瘟菌CYP51膜蛋白的制备
• 2.5 蛋白含量测定
• 2.6 CYP51含量测定及活性测定（CO差光谱）
• 2.7 药物和靶酶结合能力的光谱分析方法
• 3 结果与分析
• 3.1 杀真菌剂对稻瘟菌生长抑制作用
• 3.2 微粒体的鉴定结果
• 3.3 蛋白含量测定:牛血清蛋白的标准曲线
• 3.4 CO差光谱测定靶酶活性结果
• 3.5 不表达CYP51的E. coli蛋白、CYP51及药物随时间变化的吸收光谱结果（空白对照实验结果）
• 3.6 靶酶活性对结合光谱的影响
• 3.7 靶酶纯度对结合光谱的影响
• 3.8 靶酶浓度对结合光谱的影响
• 50的关系'>3.9 杀真菌剂的光谱分析结果与生长抑制120h-EC₅₀的关系
• 4 讨论
• 第三章 异源表达CYP51结合光谱法对不同结构药物的筛选
• 1 材料
• 1.1 生物材料
• 1.2 药物与试剂
• 2 方法
• 2.1 药物对稻瘟菌生长抑制的测试方法
• 2.2 药物与CYP51的结合光谱分析
• 3 结果与分析
• 3.1 含吲哚环类药物与CYP51的结合光谱图及结合能力分析
• 3.2 LHEXP类药物与CYP51的结合光谱图及结合能力分析
• 3.3 三唑并咪唑啉酮类药物与CYP51的结合光谱图及结合能力分析
• 3.4 咪唑啉酮类药物与CYP51的结合光谱图及结合能力分析
• 4 讨论
• 4.1 药物与CYP51的结合能力与对稻瘟菌生长抑制结果的比较与分析
• 4.2 不同结构的药物对CYP51的结合能力的比较与分析
• 5 小结
• 第四章 总结
• 参考文献
• 附录
• 在读期间已发表的论文和待发表的论文
• 致谢