鸭瘟病毒UL-6基因主要抗原域的原核表达和应用

论文摘要

此文对本研究小组发现的鸭瘟病毒（DPV）UL6基因（GenBank登录号EF055890）开展了以下系列研究:DPV UL6基因密码子偏爱性分析及多肽抗原表位预测,主要抗原域的克隆、原核表达和抗体制备,利用表达蛋白建立检测DPV抗体的间接ELISA方法,应用表达蛋白制备亚单位疫苗进行攻毒保护试验,基于UL6抗原域蛋白的间接免疫荧光和间接免疫组化检测石蜡切片中DPV方法的建立、UL6基因产物在DPV强毒人工感染鸭组织中的表达动态及定位监测等,结果如下:1.采用软件DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对DPV CHv毒株UL6基因（GenBank登录号EF055890）的氨基酸序列进行B细胞表位预测,分析结果显示在位于UL6蛋白羧基端第Thr507-Gln515、Thr521-Met529、Asp531-Phe539、Gly544-Asn562、Thr568-Gln585、Lys592-Val604、Ala681-Ala778和Tyr780-Lys790区域内含有主要抗原决定簇。将UL6编码蛋白密码子偏爱性特征与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性相比较,为选择合适的表达系统提供参考。2.以DPV CHv毒株基因组作为PCR反应模板,利用Oligo6.0软件设计一对引物,整体扩增涵盖具有优势表位的基因片段（1483-2385bp）,进行原核表达。以兔抗DEV多克隆血清进行Western blotting,检测显示抗血清可与该融合蛋白发生特异性反应。利用重组表达蛋白所带的6×His标签用镍柱亲和层析两种方法对其进行纯化,获得较高纯度的重组蛋白。过柱纯化蛋白分别对家兔进行免疫,制备兔高免血清,ELISA效价高达1:512000。3.以纯化的鸭瘟病毒UL6M蛋白为抗原,建立了用于检测鸭血清中抗DPV特异性IgG抗体的间接ELISA方法。并对其进行了标准化研究,确定了最佳工作条件。结果显示,抗原包被浓度为3.125ug/孔的包被反应板可获得良好的敏感性,与DEV标准阳性血清呈阳性反应,而与鸭乙型肝炎病毒（Duck hepatitis B virus,DHBV）、鸭病毒性肝炎（Duck virus hepatitis,DHV）、鸭传染性浆膜炎（Riemerella anatipestiferinfectious,RA）、鸭大肠杆菌（E.coli）、鸭沙门氏菌（Salmonella bacillus,SB）5种疾病阳性血清均无交叉反应。批间、批内试验变异系数不超过10%。这一结果表明该法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于鸭瘟病毒感染鸭的血清抗体检测4.应用基因工程技术获得的UL6主要抗原域蛋白制备亚单位疫苗,攻毒保护试验显示:重组亚单位疫苗免疫雏鸭,免疫后7d左右能刺激机体开始出现抗体,14d抗体效价达到最高（OD为2.535）,能够显著高于对照组（P≤0.05）,与弱毒疫苗免疫组比较,效价的消长时间与弱毒免疫组变化相似,在56d体内均维持较高水平。重组蛋白组发病率、死亡率分别为50%（5/10）、40%（4/10）明显低于对照组的100%（10/10）、100%（10/10）,表明UL6主要抗原域重组蛋白在雏鸭体内具有良好的免疫原性,但保护效率较弱毒疫苗组略差。5.检测鸭瘟病毒UL6基因产物在人工感染雏鸭组织中的表达动态与定位分布表明:感染鸭瘟病毒强毒4h,法氏囊、胸腺等免疫器官即可见UL6衣壳蛋白的表达。随后,十二指肠、空肠、回肠、直肠等消化道组织靶细胞可见UL6衣壳蛋白持续稳定地表达,3d后直至死亡鸭体内各组织器官均可检测到UL6表达蛋白的存在。由此推测DPV UL6蛋白为晚期基因中率先表达的一类,并持续参与病毒DNA复制全过程。

论文目录

• 本论文的创新性研究工作
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 疱疹病毒UL6基因的研究进展
• 1.疱疹病毒概述
• 2.UL6基因在疱疹病毒中的特征
• 3.关于UL6基因的展望
• 第二章 蛋白质B细胞抗原表位的研究方法进展
• 1 抗原表位的概念
• 2 B细胞抗原表位的理论预测法
• 3 B细胞表位的实验测定法
• 选题目的和意义
• 实验研究
• 第三章 鸭瘟病毒UL6基因B细胞表位预测及密码子偏爱性分析
• 1 材料和方法
• 1.1 数据
• 1.2 主要生物信息学分析方法
• 2.结果
• 2.1 DEV CHv毒株UL6蛋白的二级结构预测
• 2.2 DEV CHv毒株UL6蛋白亲水性预测结果
• 2.3 DEV CHv毒株UL6蛋白可塑性预测结果
• 2.4 DEV CHv毒株UL6蛋白的抗原指数预测结果
• 2.5 DPV UL6基因密码子使用频率和氨基酸组成偏爱分析
• 2.6 DPV UL6基因与大肠杆菌、酵母及人的密码子使用偏爱性比较
• 3.讨论
• 3.1 B细胞表位预测对UL6多肽链的分析
• 3.2 UL6基因密码子偏嗜性分析结果对表达的影响
• 3.3 选取截段表达的意义
• 第四章 鸭瘟病毒UL6基因主要抗原域蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备
• 1.材料
• 1.1 材料及试剂
• 1.2 引物的设计与合成
• 1.3 实验动物
• 1.4 主要溶液配制
• 2.方法
• 2.1 PCR扩增DPV CHv株UL6M基因
• 2.2 UL6M基因的T-载体克隆与鉴定
• 2.3 UL6M基因重组表达菌株的构建
• 2.4 重组表达质粒的小量诱导表达
• 2.5 表达蛋白的Western Blotting检测
• 2.6 重组质粒表达条件的优化
• 2.7 重组蛋白的纯化
• 2.8 兔抗UL6M蛋白高免血清的制备
• 2.9 兔抗UL6M IgG的纯化
• 3.结果
• 3.1 主要抗原域片段的克隆和鉴定
• 3.2 SDS-PAGE和Western blotting分析
• 3.3 重组蛋白的诱导表达及条件优化
• 3.4 重组蛋白的纯化
• 3.5 免疫兔血清的Western-blotting检测
• 3.6 免疫兔血清的ELISA抗体效价的检测
• 4.讨论
• 4.1 基于UL6基因保守区段的主要抗原域的选取
• 4.2 外源基因的融合表达的意义
• 4.3 诱导表达
• 第五章 基于UL6主要抗原域蛋白的间接ELISA检测DPV抗体方法的建立
• 1.材料
• 1.1 血清
• 1.2 主要器材
• 1.3 主要试剂
• 2.方法
• 2.1 最佳抗原包被浓度的确定
• 2.2 酶标二抗最佳工作浓度的确定
• 2.3 待检血清最佳稀释度的确定
• 2.4 ELISA检测程序流程
• 2.5 ELISA阴阳性临界值的确定
• 2.6 特异性试验
• 2.7 重复性试验
• 2.8 敏感性试验
• 3.结果
• 3.1 最佳抗原包被浓度确定的结果
• 3.2 酶标抗体和检测血清最适度的确定
• 3.3 ELISA阴阳性临界值的确定
• 3.4 特异性试验结果
• 3.5 重复性试验结果
• 3.6 敏感性试验
• 3.7 样品血清的临床检测结果
• 4.讨论
• 4.1 应用表达蛋白建立ELISA方法对鸭瘟检测的意义
• 4.2 ELISA方法的建立与优化
• 4.3 UL6抗原域蛋白间接ELISA方法的特异性
• 第六章 鸭瘟病毒UL6基因主要抗原域基因工程重组亚单位疫苗的研制及免疫原性研究
• 1 材料
• 1.1 毒株、疫苗和试验动物:
• 1.2 主要试剂及仪器:
• 2 方法
• 2.1 重组亚单位疫苗的制备
• 2.2 试验动物分组与免疫:
• 2.3 攻毒保护试验
• 2.4 血清抗体检测试验
• 3 结果
• 3.1 不同时间段鸭血清ELISA抗体效价
• 3.2 攻毒保护试验结果:
• 4 讨论
• 4.1 应用重组表达蛋白制备亚单位疫苗的研究
• 4.2 UL6主要抗原域蛋白制备重组亚单位疫苗的攻毒保护效果
• 第七章 基于DPV UL6基因主要抗原域蛋白的免疫组化方法建立及其在UL6基因功能研究和DPV强毒感染鸭组织中定位分布规律的检测
• 1 材料
• 1.1 毒株、病料及试验动物
• 1.2 免疫酶组织化学技术所需试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 实验动物人工感染DPV及样品采集
• 2.2 样品组织包埋及切片
• 2.2.1 载（盖）玻片准备
• 2.2.2 组织包埋及切片
• 2.3 间接免疫酶组化检测DPV方法的建立与优化
• 3.结果
• 3.1 免疫组化方法检测DPV的建立与优化
• 3.2 免疫组化方法检测鸭瘟病毒特异性试验结果:
• 3.3 间接免疫组化检测石蜡切片中DPV UL6基因产物在人工感染鸭体内的表达动态
• 3.4 免疫组化方法检测石蜡切片中DPV UL6基因产物在鸭体内组织定位分布
• 4 讨论
• 4.1 间接免疫组化方法的建立与优化
• 4.2 免疫组化方法对UL6基因产物在组织上的动态表达监测与其基因功能的关系探讨
• 4.3 免疫组化方法对鸭瘟病毒在鸭体组织内侵染规律的研究
• 第八章 基于DPV UL6基因主要抗原域蛋白的免疫荧光方法建立及其在UL6基因功能研究和DPV强毒感染鸭组织中定位分布规律的检测
• 1 材料
• 1.1 毒株、病料及试验动物
• 1.2 免疫荧光技术所需试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 实验动物人工感染DPV及样品采集
• 2.2 样品组织包埋及切片
• 2.3 间接免疫荧光检测DPV方法的建立与优化
• 2.4 免疫荧光检测石蜡切片中DPV UL6基因在人工感染鸭体内的表达动态
• 2.5 免疫荧光检测石蜡切片中DPV UL6基因产物在鸭体内的组织定位分布
• 3 结果
• 3.1 免疫荧光方法检测DPV的建立与优化
• 3.2 免疫荧光方法检测鸭瘟病毒特异性试验结果:
• 3.3 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV UL6基因产物在人工感染鸭体内的表达动态
• 3.4 间接免疫荧光检测石蜡切片中DPV UL6基因产物在鸭体内的组织定位分布
• 4 讨论
• 4.1 间接免疫荧光方法的建立与优化
• 4.2 免疫荧光方法对UL6基因产物在组织上的动态表达监测与其基因功能的关系探讨
• 4.3 间接免疫荧光方法对鸭瘟病毒在鸭体组织内侵染规律的研究
• 结论
• 参考文献
• 致谢