米糟蛋白提取及酶法制备抗氧化活性肽及降血压活性肽的研究

论文摘要

本文以米糟为原料,采用酶法和碱法、凝胶分离技术、高效液相色谱分离技术、质谱等手段,研究了提取米糟中蛋白质的工艺条件、大米蛋白质改性、血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽和抗氧化活性肽的工艺条件和技术方法,进一步分离和确定了具有高ACE抑制活性短肽的一级结构,并进行动物实验观察了米糟蛋白酶解物的降血压效果。 首先,确定了酶法提取米糟蛋白的最佳提取条件,即酶量1.0%、料液比1:4、pH=8.0、温度65℃、时间7h。在该条件下,蛋白质的提取率为62.6%,提取物的蛋白质含量为84.0%。碱法提取米糟蛋白质的最佳工艺条件为温度65℃、碱浓度0.8%、时间6h、料液比1:6,在该条件下蛋白质的提率为76.2%,提取物蛋白质含量为80%。酶法及碱法提取米糟蛋白质的研究结果在米糟蛋白提取研究中处于领先水平。 米糟蛋白经碱性蛋白酶改性后,其溶解性、乳化性、起泡性等性质得到了明显的改善,在中性条件下,40g/L蛋白酶解物溶液的氮溶解指数（NSI）、乳化性、起泡性分别达到了95%、55%、70%。 在本研究中首次对米糟蛋白的碱性蛋白酶酶解产物进行了抗氧化活性的探索,研究结果表明,米糟蛋白的碱性蛋白酶酶解产物不仅具有还原能力,而且还具有清除DPPH自由基的能力。对米糟蛋白酶解物、茶多酚、丁基羟基茴香醚（BHA）、Vc进行的清除DPPH自由基的能力比较结果表明,米糟蛋白酶解物清除DPPH自由基能力接近BHA。以还原能力为响应值对酶解反应进行了响应面优化研究,结果表明,酶解法获得抗氧化活性肽的最佳条件为pH7.74、温度61.5℃、料液比1:5.23。 本研究中用蛋白酶酶解的方法从米糟中获得了血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽。对中性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合风味蛋白酶、水解蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物的血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性比较结果表明,胰蛋白酶酶解物的ACE抑制活性最强。并以ACE抑制活性为响应值对酶解反应进行优化研究,结果显示,最优条件为pH8.02、温度37.0℃、蛋白酶量[E]/[S]=0.75AU、料液比（W/R）为1:4.13、水解时间4.0h,在该条件下获得的酶解物的ACE抑制活性为84.95%。有关从米糟蛋白中获得ACE抑制活性肽方面的研究尚未见报道。 通过葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离ACE抑制活性肽获得了六个多肽组分即F-Ⅰ、F-Ⅱ、F-Ⅲ、F-Ⅳ、F-Ⅴ、F-Ⅵ,其中组分F-Ⅴ的ACE抑制活性最强,其ACE抑制活性达到了84.7%,对F-Ⅴ进行的HPLC分析结果表明,F-Ⅴ中含有4个组分,其中F-Ⅴ-Ⅳ的含量占93.89%,用RP-HPLC进行制备F-Ⅴ-Ⅳ组分后用质谱分析方法研究了组分F-Ⅴ-Ⅳ的一个分子量为645肽的氨基酸一级结构,结果表明,氨基酸一级结构为FNGFY（Phe-Asn-Gly-Phe-Tyr）。 动物实验中,一次性给药实验结果显示,ACE抑制活性肽1 mg/kg组、10 mg/kg组、50 mg/kg组及卡托普利（Captopril）1 mg/kg组在给药后1h,原发性高血压大白鼠（SHR）血乐分别10.96mmHg、16.77 mmHg、26.39 mmHg、16.61 mmHg;长期给药实验结果显示,ACE抑制活性肽

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 大米蛋白质的研究概况
• 1.1 大米蛋白质的概述
• 1.2 大米浓缩蛋白（RPC）和分离蛋白（RPI）
• 1.3 大米改性蛋白
• 1.4 抗性蛋白
• 1.5 大米蛋白提取的研究现状
• 2 生物功能肽的研究概述
• 2.1 生物功能肽概述
• 2.2 生物功能肽
• 2.2.1 鸦片样活性肽
• 2.2.2 免疫调节肽
• 2.2.3 抗血栓肽
• 2.2.4 矿物质元素结合肽
• 2.2.5 抗菌肽
• 2.2.6 抗人体免疫缺陷病毒（抗爱滋病病毒）肽
• 2.2.7 抗氧化活性肽
• 2.3 食品感官肽
• 2.3.1 味觉肽
• 2.3.2 风味增强肽
• 2.4 生物活性肽的开发现状
• 3 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽
• 3.1 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽
• 3.2 血管紧张素转换酶（ACE）对血压的调节作用
• 3.3 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽的作用机制
• 3.4 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽的构效关系
• 3.5 蛋白酶法制备血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽
• 3.5.1 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽原料的选择
• 3.5.2 蛋白酶的选择
• 3.5.3 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性的评价
• 3.5.4 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽分离提取
• 3.5.5 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽的研究开发前景
• 4 选题背景及研究内容
• 第二章 用酶解法和碱法从米糟中提取食用蛋白质的研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 酶法提取蛋白质方法
• 1.3.2 碱法提取蛋白质的方法
• 1.3.3 蛋白质提取率的计算方法
• 1.3.4 大米蛋白质的最佳酸沉pH的研究方法
• 2 结果与讨论
• 2.1 蛋白酶种类对米糟蛋白提取率的影响
• 2.2 酶法提取米糟蛋白质条件的优化研究
• 2.2.1 酶法提取米糟蛋白质实验的正交实验设计及实验结果
• 2.2.2 pH值对米糟蛋白提取率的影响
• 2.2.3 反应温度对米糟蛋白提取率的影响
• 2.2.4 酶量与料液比对米糟蛋白提取率的影响
• 2.2.5 蛋白质中化学键的破坏与蛋白质水解度对米糟蛋白提取率的影响
• 2.3 碱法提取米糟蛋白质条件的优化
• 2.3.1 碱法提取米糟蛋白质实验的正交实验设计及实验结果
• 2.3.2 碱浓度和温度对米糟蛋白提取率的影响
• 2.3.3 反应料液比和反应时间对米糟蛋白提取率的影响
• 2.4 米糟蛋白质最佳酸沉pH值
• 2.5 碱法提取米糟蛋白质的工艺流程
• 3 小结
• 第三章 大米蛋白酶法改性及酶解物特性研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 大米蛋白酶解物的制备
• 1.3.2 蛋白酶解物的水解度测定
• 1.3.3 蛋白质提取率的计算
• 1.3.4 总氮量的测定：
• 1.3.5 蛋白酶解物氮溶解指数（NSI）测定
• 1.3.6 蛋白酶解物起泡性及起泡稳定性测定
• 1.3.7 蛋白酶解物乳化能力及乳化稳定性测定
• 1.3.7.1 乳化能力测定
• 1.3.7.2 乳化稳定性测定
• 1.3.8 蛋白酶解物氨基酸组成分析
• 2 实验结果与讨论
• 2.1 水解度与米糟蛋白质提取率的关系研究
• 2.2 水解度对米糟蛋白起泡性和乳化性影响
• 2.3 pH值对蛋白酶解物氮溶解指数（NSI）的影响
• 2.4 pH值对蛋白酶解物起泡性和乳化性的影响
• 2.5 蛋白酶解物的氨基酸组成分析
• 3 小结
• 第四章 从米糟中制取抗氧化生物活性肽的研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 实验仪器
• 1.3 实验方法
• 1.3.1 蛋白酶解物的制备
• 1.3.2 蛋白酶解物的水解度的测定
• 1.3.3 蛋白酶解物还原性测定
• 1.3.4 蛋白酶解物的凝胶层析
• 1.3.5 清除DPPH自由基测定
• 2 结果和讨论
• 2.1 米糟蛋白酶解物的还原性
• 2.2 米糟蛋白酶解获得抗氧化活性肽反应的优化
• 2.2.1 米糟蛋白酶解反应响应面实验设计
• 2.2.2 米糟蛋白酶解反应响应面实验结果
• 2.3 米糟蛋白酶解物防止茶多酚氧化
• 2.4 米糟蛋白酶解物的清除DPPH自由基能力
• 2.5 米糟蛋白酶解物、茶多酚、丁基羟基茴香醚（BHA）、Vc的清除DPPH自由基能力比较
• 2.6 米糟蛋白酶解物的Sephadex G-15凝胶层析分离
• 2.7 米糟蛋白酶解物Sephadex G-15凝胶层析组分的还原性
• 3 小结
• 第五章 酶解法制备血管紧张素转换酶（ACE）活性抑制肽研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 蛋白水解物的制备方法
• 2.2 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性测定方法
• 2.3 蛋白酶解物的蛋白质含量测定方法
• 2.4 实验设计与统计分析方法
• 3 实验结果及讨论
• 3.1 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽蛋白酶的筛选
• 3.1.1 单一蛋白酶酶解产物对产生ACE抑制活性肽的影响
• 3.1.2 不同蛋白酶的组合对产生ACE抑制活性肽的影响
• 3.2 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽酶解反应的优化
• 3.2.1 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽酶解反应因素筛选
• 3.2.2 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽酶解反应因素爬坡实验
• 3.2.3 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽酶解反应因素中心点实验设计（CCD）和响应面分析
• 4 小结
• 第六章 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽的分离和制备
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 米糟蛋白酶解物的制备方法
• 2.2 冻干米糟蛋白酶解物的预处理方法
• 2.3 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性测定方法
• 2.4 米糟蛋白酶解物的分子量分布测定
• 2.5 葡聚糖凝胶sephadex G-15分离组分的蛋白质含量测定
• 2.6 血管紧张素转换酶（ACE）抑制肽分离
• 3 实验结果及讨论
• 3.1 米糟蛋白酶解物的分子量分布
• 3.2 米糟蛋白酶解物葡聚糖凝胶Sephadex G-15分离
• 3.3 米糟蛋白酶解物sephadex G-15分离组分的ACE抑制活性研究
• 50)研究'>3.4 米糟蛋白酶解物sephadex G-15分离组分的ACE抑制活性的半抑制浓度(IC₅₀)研究
• 4 小结
• 第七章 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽的分离纯化及多肽一级结构式研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 主要实验仪器
• 2 实验方法
• 2.1 米糟蛋白酶解物葡聚糖凝胶sephadex G-15分离组分的制备
• 2.2 米糟蛋白酶解物各个分离组分的高效液相色谱分析
• 2.3 米糟蛋白酶解物葡聚糖凝胶sephadex G-15分离组分F-Ⅴ-Ⅳ反相高效液相色谱制备
• 2.4 米糟蛋白酶解物分离组分F-Ⅴ-Ⅳ的质谱分析
• 3 实验结果及讨论
• 3.1 米糟蛋白酶解物葡聚糖凝胶sephadex G-15分离组分
• 3.2 米糟蛋白酶解物葡聚糖凝胶sephadex G-15分离F-Ⅴ组分反相高效液相色谱制备
• 3.3 米糟蛋白酶解物葡聚糖凝胶sephadex G-15分离组分F-Ⅴ-Ⅳ质谱分析
• 4 小结
• 第八章 血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性肽的降血压动物实验研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料与仪器
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原发性高血压大白鼠（SHR）的饲养条件
• 2.2.2 原发性高血压大白鼠（SHR）血压测定
• 2.2.3 实验用米糟蛋白ACE抑制活性肽的配制
• 2.2.4 米糟蛋白ACE抑制活性肽的一次性给药实验方法
• 2.2.5 米糟蛋白ACE抑制活性肽的长期给药实验方法
• 2.2.6 统计分析方法
• 3 结果与讨论
• 3.1 米糟蛋白ACE抑制活性肽对原发性高血压大白鼠（SHR）血压影响的研究
• 3.1.1 米糟蛋白ACE抑制活性肽的一次给药对SHR血压的影响
• 3.1.2 米糟蛋白酶解物ACE抑制活性肽的长期服用对SHR血压的影响
• 3.2 米糟蛋白酶解物ACE抑制活性肽的长期服用对SHR体重的影响
• 4 小结
• 结论与后续研究
• 1 本论文的主要结论
• 2 后续研究
• 参考文献
• 致谢
• 附录