JEV多表位基因重组痘苗病毒安卡拉株（rMVA-mep）及其免疫效果评价

论文摘要

日本脑炎病毒Japanese encephalitis virus（JEV）（简称乙脑）属于黄病毒科黄病毒属,是一种由蚊虫传播引起人类或马的中枢神经系统感染的病毒性疾病。猪是JEV的中间宿主,因此,控制猪的乙脑不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。在许多亚洲国家使用的第一代疫苗是乙脑病毒的灭活苗和弱毒苗,都取得了很大的成就,但是鼠脑来源的乙脑疫苗在过敏问题上越来越突出,使用灭活疫苗的一个主要问题是缺乏长效免疫,由于需要多次重复免疫,使得免疫程序繁琐。因此国际上对改善发展新的乙脑疫苗的要求很迫切。WHO正在呼吁改善和研制新型乙脑疫苗,乙脑病毒的E蛋白与病毒和细胞受体结合、膜融合有关,也是引起中和抗体及宿主保护的主要免疫蛋白。因此,利用乙脑E蛋白研究安全、高效、廉价的新型疫苗来防制JEV具有十分重要的意义。改良型痘苗病毒安卡拉株（Modified vaccinia virus ankara,MVA,1987年11月15日保藏于CNCM,保藏号1-721）被认为是最具潜力的病毒载体之一,MVA的生活周期允许疫苗抗原在感染细胞的细胞浆中合成,对抗原分子向MHC-I类分子有效递呈,引发特异性CD8+T细胞反应特别有利。与复制型痘苗病毒不同,MVA的宿主范围很窄,对人类及其他哺乳动物仅产生一过性感染,接种后的副反应小。因此,许多利用MVA作载体的试验性疫苗已经在动物模型中显示了良好的保护性体液免疫与细胞免疫反应。由于MVA突出的安全性能和免疫原性,近年来通过基因重组构建的rMVA已被广泛应用于种重要病原和肿瘤的疫苗研制当中,并已取得良好效果。也正是由于MVA载体具有的这些优点,使其从众多的活病毒载体中脱颖而出,成为当前重组痘苗病毒活载体疫苗研究的热点。表位（epitope）是抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团,又称抗原决定簇（antigenic determinant）.它是T细胞抗原受体（T cell receptor,TCR）和B细胞抗原受体（B cell receptor,BCR）与抗体特异结合的基本单位。在免疫应答中,TCR和BCR所识别的抗原表位不同,分别被称为T细胞表位和B细胞表位。作为理想的免疫原,抗原分子中应同时包含目的抗原B细胞表位和自身或外源T细胞表位,才能诱导出高度特异性的体液及细胞免疫反应,在体液免疫和细胞免疫水平起到预防或治疗作用,赋予较广泛的保护性。目前关于表位疫苗的设计策略取得了较大的研究进展,因此表位疫苗成为近年来病毒新型疫苗研究的热点。本研究以JEV多表位肽multiple-epitope peptide（日本脑炎病毒E蛋白上6个主要的B细胞表位,一个CTL表位和一个Th表位基因串联,命名为mep,长度为437bp）为目标基因,以MVA为载体构建表达JEV多表位基因mep的重组MVA,并用重组MVA免疫小鼠研究其免疫原性及保护效力,希望为研制具有高免疫原性的乙脑病毒多表位疫苗提供依据。具体的研究内容如下：1、表达日本脑炎病毒E蛋白多表位基因重组MVA的构建及纯化以Nhel/XhoI酶切位点,从重组表达质粒pET28-MEP上扩增出mep基因克隆到pMD18-T载体,命名为pMD18-mep,测序正确保存。用NheI/XhoI双酶切pMD18-mep和转移载体pGEM-K1L,回收目的片段和载体,以合适的比例进行连接,转化宿主菌DH5a,提取质粒Nhel/Xhol双酶切鉴定,取阳性重组转移质粒保存,命名为pGEM-K1L-mep.野生型MVA感染的BHK-21细胞,培养2-3h。然后通过脂质体LipofectamineTM2000将重组转移质粒pGEM-K1L-mep转染被野生型MVA感染的BHK-21细胞,培养4-6h,换新的DMEM培养液,培养24-36h,重组转移质粒pGEM-K1L-mep与野生型MVA基因组发生同源重组,细胞病变后反复冻融3次收毒保存,命名为recombinant virus1,简称rvl,其中包含获得的重组痘苗病毒（命名为rMVA-mep）和未重组的野生型MVA。将rvl按照合适的比例感染RK-13细胞,反复传代以去除混合物里的野生型MVA,每代病毒液都进行重组痘苗病毒存在性检测。传5-6代经检测野生型MVA已完全去除的病毒液（命名为rv2）,按照合适的比例感染长成单层的BHK-21细胞,反复传代（约5-6代）以去除宿主限制性筛选基因K1L,每代病毒液都进行K1L基因存在性检测,重组痘苗病毒命名为rMVA-mep,病毒滴度为108TCID50/mL2、在小鼠模型上的免疫原性和保护效力研究4～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分成8组,每组15只。将野生型MVA（对照）、PBS（对照）和三种不同剂量（105TCIDso,106TCIDso,107TCID50） rMVA-mep分别以腹腔接种的方式给小鼠进行3次免疫,每次免疫间隔2周；将rMEP蛋白（实验室保存,浓度为10mg/mL）、EDⅢ蛋白（实验室保存,浓度为5mg/mL）和灭活苗分别以皮下接种的方式给小鼠进行3次免疫,每次免疫间隔2周。然后通过测定抗体水平、抗体亚型、中和抗体、细胞因子（IL-4和IFN-γ）和淋巴细胞增殖水平,并做了攻毒保护试验来衡量重组痘苗病毒rMVA-mep的免疫效果。结果表明,rMVA-mep既能诱导体液免疫又能诱导细胞免疫。抗体亚型分析结果表明,rMVA-mep既能诱导IgG1的分泌又能诱导IgG2a的分泌,但以IgG1为主；细胞因子检测结果进一步表明rMVA-mep主要诱导IFN-y的产生,因此说明rMVA-mep既能诱导产生Th1型免疫应答,也能诱导产生Th2型免疫应答。攻毒实验结果表明：PBS对照组存活率为8.33%（12只小鼠,存活1只）。与PBS对照组比较,野毒MVA免疫组的存活率为0。最高免疫剂量为107TCID50的rMVA-mep免疫组存活率为100%,与rMEP蛋白免疫组、EDⅢ蛋白免疫组和灭活苗免疫组存活率（100%）一致。因此rMVA-mep可以作为一种候选的基因工程重组病毒亚单位疫苗。综上所述,构建的乙脑病毒E蛋白多表位基因重组痘苗病毒能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫应答反应,对致死量的乙脑病毒感染具有保护作用,从而为研究安全有效的乙脑疫苗提供了新的思路和方法。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 第一部分 文献综述
• 第一章 日本乙型脑炎的研究背景
• 1 JEV的分类
• 2 乙脑流行的危害
• 3 乙脑的流行模式
• 4 乙脑的生物学研究进展
• 4.1 病毒基因组结构与功能
• 4.2 病毒蛋白的结构与功能
• 4.3 乙型脑炎病毒的侵染和复制
• 5 乙型脑炎病毒的毒力和致病机理
• 5.1 分子水平上的毒力研究
• 5.2 乙型脑炎的致病机理
• 6 乙型脑炎诊断技术研究进展
• 6.1 病毒的分离鉴定
• 6.2 血清学诊断
• 6.3 病原学检查
• 7 乙脑疫苗研究进展
• 7.1 传统疫苗
• 7.2 基因工程疫苗
• 8 展望
• 参考文献
• 第二章 痘病毒载体概述
• 1 MVA的生物学特性
• 1.1 MVA的起源
• 1.2 MVA的生长许可性
• 1.3 MVA的基因缺失情况
• 1.4 MVA的体内免疫特性
• 2 构建重组MVA的方法
• 2.1 构建原理
• 2.2 构建重组MVA的基本元件
• 2.3 重组MVA的筛选
• 3. MVA表达载体的优越性
• 4. 重组MVA的应用
• 4.1 表达噬菌体T7RNA聚合酶
• 4.2 表达流感病毒血凝素和核蛋白
• 4.3 表达SIV三价抗原（gag-pol和env）
• 4.4 表达麻疹病毒（MV）溶解素和血凝素糖蛋白
• 4.5 结核疫苗研究
• 4.6 表达疟疾红前期抗原CSP
• 4.7 肿瘤的免疫治疗研究
• 5 展望
• 参考文献
• 第三章 E蛋白表位概述
• 1 E蛋白抗原研究历史及现状
• 2 E蛋白多表位抗原表位选择
• 3 表位传递
• 3.1 脂肽
• 3.2 多价抗原肽
• 3.3 多表位线形肽
• 3.4 受体连接的多肽传递系统
• 3.5 靶向多肽类（targeting polypeptides）
• 4 前景展望
• 参考文献
• 第二部分 试验研究
• 第四章 JEV E蛋白多表位基因重组MVA的构建及纯化
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 质粒和菌株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 引物设计
• 2.2 目的基因的扩增
• 2.3 连接及转化
• 2.4 重组克隆载体的酶切鉴定和mep基因的序列测定
• 2.5 痘苗病毒转移载体pGEM-K1L-mep的构建
• 2.6 重组痘苗病毒的获得
• 2.7 重组痘苗病毒的筛选
• 2.8 蛋白印迹
• 2.9 重组痘苗病毒生长曲线的测定
• 3 结果
• 3.1 多表位基因（mep）的扩增
• 3.2 重组克隆载体pMD18-mep的酶切鉴定
• 3.3 多表位基因（mep）的测序结果
• 3.4 重组转移载体pGEM-K1L-mep的酶切鉴定
• 3.5 转移载体pGEM-K1L-mep与野生型MVA同源重组
• 3.6 重组痘苗病毒在RK-13细胞上的筛选
• 3.7 重组痘苗病毒在BHK-21细胞上去除K1L基因
• 3.8 重组痘苗病毒的蛋白印迹
• 3.9 重组痘苗病毒在BHK-21细胞上的生长特性
• 4 讨论
• 参考文献
• Abstract
• 第五章 动物实验
• 摘要
• 1 材料
• 1.1 重组毒,重组蛋白,细胞和毒株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 动物
• 1.4 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 小鼠免疫与攻毒实验
• 2.2 T淋巴细胞增殖情况
• 2.3 抗体及抗体亚型分析
• 2.4 中和抗体检测
• 2.5 血清中IL-4和IFN-1,的测定
• 2.6 统计分析
• 3 结果
• 3.1 JEV病毒抗体和抗体亚型检测
• 3.2 中和抗体滴度测定
• 3.3 细胞因子检测
• 3.4 MTT结果
• 3.5 对致死量的JEV的保护力
• 4 讨论
• Abstract
• 参考文献
• 全文总结
• 在读期间论文及专利成果
• 致谢