锌脂蛋白A20抑制TLR4介导的人单细胞炎症反应的实验研究

论文摘要

目的:应用TLR4特异性激动剂脂多糖（LPS）刺激体外培养的人单核细胞,激活TLR4/NF-κB信号途径,将含有A20基因的质粒转染入单核细胞进行干预,观察A20过表达后单核细胞膜受体TLR4表达的变化,以及对下游促炎因子TNF-α、IL-12及抗炎因子IL-10表达的调节,并进一步研究A20过表达对促炎因子/抗炎因子即TNF-α/ IL-10和IL-12/ IL-10比率的影响,以探讨锌脂蛋白A20对单核细胞炎症反应的保护作用及可能的调节机制。方法:外周血经EDTA抗凝,Ficoll细胞分离液分离外周血单个核细胞,将单核细胞贴壁培养于不含血清的RPMI-1640培养液中,调整单核细胞浓度为1×105个/ml,实验设A组（为空白对照组,培养液中不加任何干预因素）;B组（为LPS组,无血清培养48小时,在培养基中加入1mg/L的LPS作用24小时）; C组（为A20转染组,无血清培养24小时,转染pCAGGS-GFP/A20质粒阳离子脂质体复合物培养48小时）; D组（为LPS+A20转染组,无血清培养24小时,转染pCAGGS-GFP/A20质粒阳离子脂质体复合物培养48小时,于转染过程中加入1mg/L的LPS作用24小时）。胰酶消化法收集以上各组单核细胞;采用免疫荧光方法检测GFP报告基因,免疫组化检测A20蛋白的表达;提取总mRNA用RT-PCR检测内源性A20、外源性A20及TLR4的mRNA表达;应用流式细胞检测技术检测TLR4的表达,以CD14+为单核细胞标记,采用未转染的细胞进行调零,记录荧光阳性细胞的百分率;采用双抗体夹心ELISA方法检测上清液TNF-α、IL-12及IL-10表达水平。结果:1.单核细胞受到LPS（1mg/L）刺激后,其自身受体TLR4和内源性A20的mRNA和蛋白表达以及促炎因子TNF-α、IL-12和抗炎因子IL-10表达较对照组均明显升高;TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10的比率均明显高于对照组。2.转染A20基因的单核细胞,在无LPS刺激的条件下,其自身受体TLR4和内源性A20的mRNA和蛋白表达以及促炎因子TNF-α、IL-12和抗炎因子IL-10的表达与对照组相比均无明显变化;TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10的比率与对照组相比也无明显变化。3.转染A20基因的单核细胞在受到LPS（1mg/L）刺激后,其自身受体TLR4mRNA和蛋白表达以及促炎因子TNF-α、IL-12的表达均显著低于LPS组,而抗炎因子IL-10的表达明显上调,高于对照组和LPS组;而TNF-α/IL-10和IL-12/IL-10的比率明显下降,低于LPS组。结论:1.TLR4激活介导单核细胞的炎症反应,且正反馈调节其自身受体TLR4和内源性A20的表达上调;A20参与单核细胞TLR4激活所介导的炎症反应,其表达增加与TLR4表达的增加有关。2.单纯提高A20表达对未被激活的单核细胞TLR4及其信号通路影响不大,提示A20不直接引起炎症反应,其作用具有炎症或TLR4活化依赖性。3.A20过表达可抑制TLR4激活所介导的单核细胞的炎症反应,其机制是负反馈抑制TLR4的表达,进而抑制促炎因子的表达,增加抗炎因子的表达,改善促炎因子/抗炎因子的平衡关系,从而达到抑制炎症反应的作用。4.本研究提示:通过基因转染增加A20的表达,可抑制炎症过程中单核细胞参与的炎症反应,该研究为基因治疗动脉粥样硬化等炎症性疾病提供了重要的理论和实践依据。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢