枯草芽孢杆菌中性蛋白酶nprE的定向进化研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌中性蛋白酶（neutral protease）,是一类被广泛应用于工业生产的酶类,在洗涤剂、制革、丝绸、食品加工等多种行业上有着广泛的用途。本课题主要是通过体外定向分子进化技术,改造nprE基因,从而构建能够高效稳定生产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。主要结果如下:1.运用PCR技术,从枯草芽孢杆菌标准株扩增出强启动子P43序列和nprE全长基因。克隆到pMD18-T载体中,鉴定了上述基因。标准株nprE序列与已公布序列完全相同。2.鉴定了产蛋白酶效率较高的11株分离株,PCR扩增得到其中8株的nprE全长基因。3.构建枯草芽孢杆菌原核表达载体pNP43-nprE,重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株,并在枯草芽孢杆菌中表达,12%SDS-PAGE电泳分析,重组菌可表达分子量分别约为42kDa的蛋白。经抗生素压力选择后,表达量在OD600为0.8时,酶产量出现最高,粗酶液酶活力达到了出发菌株的3倍。3.以nprE全长基因为出发点,应用基因家族改组（Familly DNA Shuffling）技术,以标准株和野生型菌株的nprE基因作为材料,对其进行突变。在酶产率未提高的情况下,第一轮筛选,突变株酶活力提高了126%,以第一轮筛选的高活力突变株为基础进行第二轮突变和筛选,酶活力又提高了将近90%,且能够稳定遗传。分析表明,nprE基因的碱基发生了改变。这种改变引起了其产物中性蛋白酶分子的氨基酸的改变,从而造成酶活力的改变。通过比较,发现应用表达载体在抗生素压力下提高了酶的产量。定向进化则改变了基因结构从而提高了酶活力,相比表达载体更为经济和稳定。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词（ABBREVIATIONS）
• 1.文献综述
• 1.1 枯草芽孢杆菌简介
• 1.2 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.2.1 芽孢杆菌表达系统的载体
• 1.2.2 常用的芽孢杆菌表达系统的问题及对策
• 1.3 突变的类型及其遗传学效应
• 1.3.1 突变的共同特性
• 1.3.2 突变的遗传学效应
• 1.3.3 突变的遗传学
• 1.4 DNA改组（DNA Shuffling）技术的发展和应用
• 1.4.1 DNA Shuffling技术的产生
• 1.4.2 DNA Shuffling技术的原理及步骤
• 1.4.3 经典DNA Shuffling技术的改进
• 1.4.4 DNA Shuffling技术的发展和延伸
• 1.5 芽孢杆菌的蛋白酶研究
• 2.材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体和菌株
• 2.1.2 主要试剂及药品
• 2.1.3 主要溶液及缓冲液
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 PCR引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 枯草芽孢杆菌nprE基因的PCR扩增和纯化
• 2.2.2 重组质粒的构建
• 2.2.3 枯草芽孢杆菌nprE基因家族改组策略
• 2.2.4 重组子筛选与第二轮改组
• 2.2.5 中性蛋白酶粗酶的制备
• 2.2.6 中性蛋白酶的分离纯化
• 2.2.7 粗酶活力测定方法
• 2.2.8 中性蛋白酶的SDS-PAGE分析
• 3 结果与分析
• 3.1 枯草芽孢杆菌基因组提取及目的基因的扩增
• 3.1.1 细菌基因组DNA的提取
• 3.1.2 PCR克隆中性蛋白酶全长基因片段
• 3.1.3 野生枯草芽孢杆菌的nprE基因扩增
• 3.1.4 P43启动子的扩增
• 3.2 重组大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体PNP43-nprE的构建
• 3.2.1 P43-nprE连接片段的鉴定
• 3.2.2 重组质粒双酶切鉴定
• 3.3 突变株的筛选与鉴定
• 3.3.1 酪氨酸标准曲线的绘制
• 3.3.2 突变株的筛选及与表达株的对比
• 3.3.3 水解酪蛋白试验
• 3.3.4 nprE基因产物的SDS-PAGE分析
• 4.讨论
• 4.1 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶
• 4.2 有关蛋白酶突变株的筛选方法
• 4.3 基因表达系统的选择
• 4.4 实现稳定表达的策略
• 5 小结
• 5.1 研究结果
• 5.2 创新点
• 5.3 存在的不足
• 参考文献
• 致谢