藓化饮对体外培养的口腔上皮细胞增殖活性的影响及PCNA在口腔扁平苔藓组织中的表达及意义

论文摘要

目的:口腔扁平苔藓（Oral Lichen Planus, OLP）是常见的口腔黏膜病,病因不明,发病机制尚不完全清楚,可能是遗传、环境及生活方式等多因素间的相互作用的结果。2 %～3 %的患者可发生恶变[1]。OLP患者的上皮萎缩性改变和慢性迁延病程都与癌变有着密切关系,部分OLP病损中存在上皮异常增生或局部癌变,WHO将OLP归为癌前状态。目前临床上还没有一种特效疗法能够治愈口腔扁平苔藓,西药治疗常出现一些副作用。近年来,临床上采用中医中药治疗口腔扁平苔藓显示出优势。细胞凋亡和细胞增殖的失调都导致恶性肿瘤的发生。如何及早发现癌前病变的高危相,如何找到一个可靠而且客观简便的方法指导临床治疗,进行预后判断和癌变危险性的估计,选择有效的治疗措施,已成为口腔临床医学领域的重要课题。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）是一种36KD核蛋白,是DNA聚合酶的辅助蛋白,对细胞增殖的启动有重要作用。现已证实,PCNA在细胞周期的G1期开始升高,在S期即合成期达到最高峰,在M期即有丝分裂期降到最低。已发现,其在肺癌、膀肤癌及胃癌中可作为独立的指标。随着人们对PCNA的广泛研究和认识,PCNA作为检测肿瘤细胞增殖的一个指标己日趋成熟。我们在以往的临床实践中应用中药藓化饮治疗口腔扁平苔藓取得了良好的临床效果。为了探讨藓化饮的作用机制,我们采用DispaseⅡ及胰酶消化法,以临床上弃去的正常黏膜为供体,进行人口腔黏膜上皮细胞的原代培养及传代培养,并将藓化饮作用于培养体系中,观察藓化饮提取液对口腔黏膜上皮细胞的作用,探讨藓化饮的作用机制,并为藓化饮治疗口腔扁平苔藓提供理论依据。同时,采用免疫组织化学的方法检测口腔扁平苔藓和口腔高分化鳞癌组织中PCNA的表达及相互关系,以探讨PCNA在口腔扁平苔藓发生、病程进展过程中的作用。方法:1体外培养口腔黏膜上皮细胞原代培养:口腔黏膜来自经患者同意后,健康供者（7-28岁）黏液腺囊肿切除术周边弃去的黏膜组织及完全埋伏的阻生齿上覆盖的正常牙龈黏膜。组织立即保存于无菌PBS液中,半小时内移入超净工作台。PBS洗净血迹,新洁尔灭和硫酸庆大霉素联合消毒10min。放入0.25%的DispaseⅡ中4℃下消化16～20h后,分离上皮。在0.125%胰蛋白酶与0.02% EDTA（1:1）的混合消化液中37℃下消化5～8 min,终止消化,离心,弃上清,在K- SFM中重悬,计数,置37℃5%CO2细胞培养箱中静置培养。传代培养:当细胞达到80%～90%汇合时,吸去培养液,0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA（1:1）消化细胞无血清培养基重悬细胞沉淀,细胞悬液以1:2的比例接种于培养瓶中继续培养。来源鉴定:取第2代生长良好的上皮细胞,接种于无菌六孔板中的盖玻片上,放入37℃5%细胞培养箱中孵育,细胞长满玻片时取出,PBS中漂洗。95%乙醇固定15min, PBS漂洗,作为实验组和空白对照,进行鼠抗人单克隆角蛋白抗体（AE1/AE3）免疫组化染色。在人口腔黏膜上皮消化后,将揭去上皮后剩余的上皮下组织进行组织块法培养成纤维细胞,爬片,实验方法同实验组,作为阴性对照。实验组和阴性对照滴加一抗工作液（效价1:80）,空白对照滴加PBS。光学显微镜下观察,细胞胞浆中有棕色颗粒为阳性,即可证明其为外胚层来源的上皮细胞。2藓化饮对口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响藓化饮提取液的制备:将黄柏、佩兰、砂仁、赤芍等草药按一定比例混合,水提醇沉法制成质量浓度为每ml含1 g生药的药液,脱色、过滤。用K-SFM稀释为10μg/ml, 100μg/ml, 500μg/ml, 1000μg/ml 4种不同浓度的藓化饮提取液。MTT法检测上皮细胞的增殖活性:取生长良好的第2代培养的口腔黏膜上皮细胞,接种于96孔板,随机分为4个实验组和1个对照组,每组选5个孔。孵育3d后实验组加入无血清培基稀释的4个浓度梯度的藓化饮提取液,对照组加入无血清培基,继续培养5d后,MTT法酶联免疫检测仪在492nm波长下检测各孔OD值,分析藓化饮提取液对上皮细胞增殖活性的影响。3免疫组化染色法检测口腔扁平苔藓组织中PCNA的表达选取河北医科大学第四医院病理科2002-2008年存档的蜡块和口腔科活检或手术切取的组织（经10%福尔马林固定,石蜡包埋）标本共80例,其中口腔扁平苔藓50例,口腔高分化鳞状细胞癌20例,口腔正常黏膜10例。采用免疫组化方法检测口腔扁平苔藓组织、口腔高分化鳞状细胞癌组织、口腔正常黏膜组织中PCNA的表达情况,并分析对比三者之间是否存在差别。同时,分析对比扁平苔藓伴有鳞状上皮增生组织与不伴有鳞状上皮增生组织PCNA的表达情况;分析对比伴有糜烂的扁平苔藓组织与不伴有糜烂的扁平苔藓组织中PCNA的表达情况;所有资料应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,P<0.05具有统计学意义。结果:1口腔黏膜上皮细胞培养原代培养口腔黏膜上皮细胞生长特性的观察:倒置相差显微镜下,胰酶消化后可见不规则的扁平细胞,体积较大的球形细胞和体积较小的球形细胞。接种后24h后部分细胞贴附于瓶底,刚贴壁的细胞折光性强。随后细胞继续贴壁,细胞伸出短小伪足,逐渐伸展。完全伸展的细胞呈扁平的椭圆形或多角形,胞核清晰,位于细胞中央,核仁1～2个。第3d时,细胞数量明显增多。培养7d左右时,细胞生长明显加快,核分裂像多见,进入指数生长期,细胞逐渐融合成片,如铺路石状镶嵌。口腔黏膜上皮细胞传代生长特性的观察:细胞生长至80%～90%汇合时传代。传代细胞贴壁比原代细胞快。在增殖期间细胞呈椭圆形或多角形,核分裂相多见,出现接触抑制现象,未复层生长,仍呈铺路石状排列,与原代细胞形态相似。倒置显微镜观察,在整个细胞生长期间,无成纤维细胞混杂生长,为单一的上皮细胞。HE染色:光镜下可见细胞成多边形,核呈蓝紫色,胞浆染成粉红色,均匀,胞体丰满伸展良好,核圆核仁清晰。细胞连接成片,呈铺路石状,可见核分裂相。免疫组化染色:光镜下可见实验组细胞角蛋白染色阳性,可见上皮细胞胞浆呈均匀的棕黄色,胞核呈淡蓝色。阴性对照组成纤维细胞角蛋白染色阴性;空白对照组所培养细胞角蛋白染色阴性。口腔黏膜上皮细胞增殖的活性:经酶标仪在492处的读数,对照组的OD值为0.035;实验组10μg/ml, 100μg/ml, 500μg/ml, 1000μg/ml的OD值分别为0.067,0.117,0.053,0.042。在100μg/ml浓度下增殖活性吸光度（OD）值明显高于其他浓度和对照组（P<0.05）。在10μg/ml,500μg/ml,1000μg/ml浓度下增殖活性吸光度（OD）值虽高于对照组,但无统计学意义（P﹥0.05）。2增殖细胞核抗原（PCNA）的表达正常口腔黏膜PCNA阳性细胞见于部分基底层细胞,呈线状排列,数量较少,其它层次未见有阳性反应。口腔扁平苔藓组织中PCNA阳性表达定位于细胞核内,阳性细胞主要分布在基底细胞层,并可累及到部分棘细胞下层。与正常口腔黏膜组织比较,PCNA阳性细胞数量增加,染色加深。与高分化鳞癌组织比较,扁平苔藓组织中PCNA着色较高分化鳞癌组织中的浅,分布范围也明显小于后者。PCNA的表达在口腔扁平苔藓组织、高分化鳞癌组织和正常口腔黏膜组织中均有明显差异（P<0.05）。不伴有糜烂的扁平苔藓组织中PCNA阳性细胞多集中在基底层和其附近的棘层,而伴糜烂的扁平苔藓中阳性细胞分布较前者更接近表层,前者高表达率24%,而后者高达67%,二者统计学有明显差异（P<0.05）。扁平苔藓不伴鳞状上皮增生组织中PCNA高表达率达20%,扁平苔藓伴有鳞状上皮增生组织中PCNA高表达率为66%,后者染色阳性细胞所占比例较前者明显增高。前两者与口腔高分化鳞癌组织中PCNA的表达相比,在染色颗粒的深浅和范围及阳性细胞所占比例上,呈逐级递增状态,高表达率差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1使用无血清培养基可成功进行人口腔黏膜上皮细胞原代培养及传代培养。2藓化饮在浓度为100μg/ml下能明显促进体外培养的人口腔黏膜上皮细胞的增殖活性。3口腔扁平苔藓组织中PCNA的高表达率高于正常口腔黏膜,且低于口腔高分化鳞癌组织中PCNA的高表达率。口腔扁平苔藓具有癌变潜能。4伴有糜烂的扁平苔藓组织中PCNA高表达率显著高于不伴有糜烂的扁平苔藓组织中PCNA的高表达率,提示临床上对伴有糜烂的扁平苔藓更要引起重视。5扁平苔藓伴鳞状上皮增生的组织中PCNA高表达率显著高于扁平苔藓不伴鳞状上皮增生组织中PCNA的高表达率,但低于口腔高分化鳞癌组织中PCNA的高表达率。随着组织学上病变程度的加重, PCNA染色阳性细胞所占比例增加,潜在恶性度增高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 藓化饮对体外培养的人口腔黏膜上皮细胞增殖活性的影响
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 PCNA 在口腔扁平苔藓组织中的表达及意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述 口腔粘膜上皮细胞培养的研究进展
• 致谢
• 个人简历