论文摘要
背景:研究表明干细胞移植可以取代坏死心肌细胞、增加有功能的心肌细胞数量,增加血管密度,改善心功能,从而为治疗缺血性心肌病开辟了一条崭新的途径。改善缺血心肌的首要任务就是改善血供,血管内皮生长因子（vascu lar endothelium growth factor,VEGF）在血管新生方面具有重要意义。虽然通过过表达VEGF的基因治疗可以改善心肌缺血,但是却不能控制VEGF的过度表达而产生癌变。本实验通过低氧反应元件（hypoxic response element,HRE）控制VEGF的表达,使骨髓间充质干细胞在低氧下表达VEGF,而常氧下VEGF表达关闭,研究受HRE调控的VEGF基因转染的骨髓间充质干细胞能否在缺血、缺氧状态下保护心肌细胞,促进血管再生,同时又防止VEGF基因过度表达,从而为基因修饰干细胞治疗缺血性心肌病提供理论依据。第一部分大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养及心梗模型的建立第一节大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）的分离、培养目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞体外培养方法,为自体骨髓移植提供材料。方法:大鼠的骨髓MSCs分离纯化后,流式细胞仪检测细胞周期。结果:体外培养的原代MSCs 10～14d达到汇合,细胞周期显示75 %的细胞处于G0/G1期。结论:根据黏附特性分离的大鼠骨髓MSCs在体外条件下可生长扩增,可用于自体骨髓移植。第二节心梗模型的建立目的:用液氮冷冻法建立大鼠心梗模型。方法:对大鼠用液氮中浸泡过的金属棒直接接触左室前壁,建立心梗模型。结果:心超资料显示建模前心功能与建模后心功能比有统计学差异,建模前的心功能明显好于建模后。结论:液氮冷冻法可以成功构建心梗模型。第二部分HRE-VEGF表达载体的构建第一节VEGF表达载体的构建目的:克隆VEGF的cDNA,将其与表达载体结合,构建成VEGF -cDNA表达载体。方法:根据已经公布的VEGF的CDS功能区的基因序列,应用RT-PCR技术从Hep G2细胞中扩增VEGF基因（1239bp）,并将其克隆至载体pCDH1-MCS1-EF1- copGFP,构建VEGF表达载体,并转化DH5α感受态细菌。选择阳性克隆菌,行双酶切鉴定和测序验证所获取的cDNA。结果:双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的cDNA为VEGF的CDS功能区基因。结论:使用RT-PCR法成功构建VEGF表达载体。第二节HRE-VEGF表达载体的构建目的:人工设计低氧反应元件串联重复序列,克隆后插入VEGF目的基因表达载体并经测序证实。方法:按照人促红细胞生成素基因3′末端HRE增强子序列,人工设计合成首尾末端部分互补的单链DNA通过3次酶切、连接的方法获得9HRE,然后通过退火及延伸合成两端带有酶切位点的包含9个串联排布的HRE的双链DNA,克隆到VEGF表达载体后测序。结果:双酶切鉴定和测序结果均表明所获取的经测序证实9HRE-VEGF和设计相符。结论:运用同尾酶法可成功构建9拷贝缺氧反应元件,构建9HRE-VEGF表达载体。第三部分慢病毒介导HRE-VEGF基因转染MSCs及HRE对转基因MSCs在缺氧、复氧心肌细胞中的调控作用第一节慢病毒介导HRE-VEGF基因转染骨髓间充质干细胞目的:用慢病毒系统（pPACKH1- Lentivector Packaging Kit）将目的基因HRE-VEGF包装并转染干细胞。方法:结合HRE-VEGF的穿梭质粒pCDH1转染包装细胞293T细胞进行扩增后,使用由三个质粒组成的慢病毒转染系统进行基因重组,并以其为载体转染鼠的骨髓间充质干细胞,检测其荧光的表达。结果:293T细胞和MSCs24转染小时和48小时后,均可检测到强荧光出现。结论:慢病毒载体系统携带目的基因HRE-VEGF基因转染鼠的骨髓间充质干细胞具有较高的转染效率。第二节转基因骨髓间充质干细胞对缺氧心肌细胞的影响目的:低氧反应元件对缺氧、复氧心肌细胞转导的VEGF基因表达的调控。方法:原代培养心肌细胞,按不同的干细胞加入不同缺氧、复氧时间将心肌细胞分组,每组细胞固定后做免疫荧光染色测细胞内VEGF蛋白的表达情况;RT-PCR测细胞内人VEGF–mRNA含量;取细胞培养液ELISA法检测人VEGF含量。结果:在缺氧组检测到VEGF–mRNA和VEGF蛋白的表达,而常氧组未检测到VEGF–mRNA和VEGF蛋白的表达。结论:离体培养大鼠心肌细胞在低氧、复氧过程中加入携带HRE-VEGF基因的骨髓间充质干细胞时,其中的HRE对转导的VEGF基因表达具有调控作用。第四部分转HRE-VEGF基因的MSCs自体移植对大鼠缺血性心肌病的实验研究目的:以心梗的大鼠为模型,研究移植转染HRE-VEGF基因的自体MSCs能否在体内较未转基因的MSCs更显著地改善缺血性心肌病大鼠的心脏功能,进一步探讨MSCs联合基因转染用于治疗缺血性心肌病的可行性。方法:选用雄性Fischer 344大鼠,体重200～250g,应用液氮冷冻法建立心梗模型,行血流动力学检测心功能。动物分成4组:空白组（A组,n=20）、DMEM组（B组,n=20）、MSCs组（C组,n=20）和转基因组（D组,n=20）。从大鼠股骨取骨髓,用贴壁筛选方法分离纯化、体外扩增MSCs,MSCs体外转染慢病毒包装的HRE-VEGF基因。将BrdU标记的自体MSCs直接注射到梗死区。4周后,重复心功能检查,评估心功能和梗死区的灌注;并观察心脏组织的病理学变化。采用ELISA法检测血浆VEGF在梗死后和干细胞移植前后的变化,以及检测Cx-43,Ⅷ因子等指标观察不同的处理对血管新生的影响。结果:大鼠MSCs移植后4周,血流动力学测定显示,C、D组LVDP较A、B组升高（P<0.05）,左心室压力变化率±dp/dtmax C、D组明显优于A、B组（P<0.05）。D组与C组相比:D组±dp/dtmax较高。移植的MSCs能防止梗塞区变薄和扩张;与A、B两组和移植前相比,梗死区的收缩功能和血流灌注均有所改善（P<0.05）,心功能的改善在D组更为明显（与C组比较,P<0.05）。与A、B两组相比,C、D组梗死区的毛细血管密度明显增加（P<0.05）,其中D组较C组增加明显（P<0.05）。VEGF的水平在梗死后有所增加,在细胞移植后一周出现高峰,后逐渐下降。结论:转染HRE-VEGF的MSCs可以改善缺血心肌的左室功能,促进血管新生。这种改善可能是MSCs通过心肌再生防止梗死区变薄、抑制收缩功能异常有关。一些细胞因子在其中起非常重要的作用。VEGF的表达可以减少细胞的凋亡,提高干细胞再生血管的作用,从而可显著改善心脏功能。应用HRE-VEGF基因转染MSCs不仅理论上可以防止癌变而且能够改善心功能。