马尾松优良家系遗传多样性的ISSR及EST-SSR研究

论文摘要

马尾松（Pinus massoniana Lamb.）是我国南方主要的乡土造林树种和工业原料树种,具有分布广泛,适应性强,产品用途广等特点。所以马尾松良种选育就显得尤为重要,而在进行马尾松优良性状筛选的过程中保持其家系的遗传多样性则是保持种子园持续有效发展的必要条件。本实验通过对25个优良家系的72个单株进行ISSR和EST分子标记研究,主要结果如下：1.本文研究了马尾松EST-PCR体系：本研究以马尾松DNA为实验材料,通过对EST-SSR PCR反应体系中的模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs、Mg2+、引物和引物退火温度进行了分析,获得稳定可靠的马尾松EST-SSR PCR的最优体系为：20μL体系中含有2gL10Buffer （Mg2+Free）,30ng模板DNA,0.1875mmol/L dNTPs,3.75mmol/L Mg2+,8pmol引物,1.0U Taq DNA聚合酶,退火温度为56℃。反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸7min；4℃保存。探讨退火温度时,用PCR仪的梯度功能,在55℃-62℃内8个梯度进行扩增。2.从100条ISSR引物中筛选出9条稳定,多态性好的引物,对25个马尾松优良家系及个体进行了PCR扩增,用POPGENE32对扩增结果遗传多样性分析结果表明,马尾松优良家系的观察等位基因数目为1.9820个,有效等位基因数目为1.4714,多态位点百分比（P）达到98.2%,总shannon信息指数（I）和总Nei’s基因多样性（h）分别为0.4538、0.2927,马尾松家系之间的遗传分化指数Gst为0.7429,基因流Nm为0.8730<1,说明种群间基因流动,不足以防止遗传漂变引起种群间的遗传分化。均显示该马尾松种子园优良家系虽然经过多次选择还保留有极高的遗传多样性和复杂性。聚类分析表明,同一家系的个体大部分聚在一起,在基因水平上显示出较近的遗传关系,但其中也有个体有变异存在。总体结果来看,实验中所选马尾松优良家系间遗传多态性比较丰富,研究结果也表明,虽然经过优良性状的多次选择,马尾松还是保持有较高的遗传多样性,可见现有的种子园建园方式是可取的。3从51对ESR-SSR引物中筛选了6对可用引物对马尾松优良个体进行遗传多样性分析,结果表明：多态位点有27个,多态位点百分比（P）高达99%,平均观察基因多样性指数（h）达到0.3347,香农多样性指数（1）为0.4927。从EST-SSR聚类图上也可以看出,性状优良的优株较多的聚为一类,推测可能有某些与生长性状有关的位点相同才使得性状优良的优株和家系拥有较近的亲缘关系。4.文中用以研究马尾松遗传多样性的两种标记方法各有各的特点,在分析遗传多样性时ISSR标记便显出较多的多态位点和多样性,且条带稳定,多态性好,可重复性强。而EST-SSR标记来自表达序列,与性状关联,为分子育种提供条件。从这个意义上来讲,两种分子标记的信息应该比单一的标记技术获得的信息更为全面。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 引言
• 1.1 马尾松的研究概况
• 1.1.1 马尾松的形态特性
• 1.1.2 马尾松的主要习性
• 1.1.3 马尾松的地理分布
• 1.1.4 马尾松的用途及经济价值
• 1.1.5 马尾松研究进展
• 1.2 DNA标记技术的发展及国内外研究现状
• 1.2.1 遗传标记与分子标记的概念
• 1.2.2 分子标记的种类及特点
• 1.2.3 分子标记技术在松属植物中的应用和发展
• 1.3 马尾松分子标记研究
• 1.4 研究的目的和意义
• 1.5 技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 供试材料地概况
• 2.1.2 供试马尾松材料类型
• 2.1.3 供试马尾松材料的采集
• 2.2 主要试验设备、试剂及所需溶液的配置
• 2.2.1 主要试验设备
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要溶液的配置
• 2.2.4 引物的筛选及结果
• 2.2.5 数据处理与统计分析方法
• 3 DNA的提取和PCR体系建立
• 3.1 基因组DNA的提取
• 3.1.1 DNA提取方法
• 3.1.2 马尾松基因组DNA质量与含量检测
• 3.2 PCR扩增反应体系
• 3.2.1 ISSR-PCR扩增反应的初步体系探讨
• 3.2.2 EST-PCR扩增反应的初步体系探讨
• 3.3 EST-PCR反应体系优化
• 3.3.1 DNA模板用量对EST-SSR PCR扩增的影响
• 3.3.2 Taq DNA聚合酶量对ESR-SSR PCR扩增的影响
• 2+浓度对ESR-SSR PCR扩增的影响'>3.3.3 Mg²⁺浓度对ESR-SSR PCR扩增的影响
• 3.3.4 dNTPs浓度对ESR-SSR PCR扩增的影响
• 3.3.5 引物用量对EST-SSR PCR扩增的影响
• 3.3.6 退火温度对EST-SSR PCR扩增的影响
• 3.3.7 对优化的PCR体系的检验
• 3.3.8 PCR最佳反应体系
• 4 遗传多样性分析
• 4.1 ISSR引物的扩增结果分析
• 4.1.1 群体分析
• 4.1.2 个体分析
• 4.2 EST-SSR遗传多样性分析
• 4.2.1 群体分析
• 4.2.2 个体分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 马尾松DNA的提取及纯度
• 5.2 PCR反应体系及其稳定性的讨论
• 5.3 遗传多样性
• 5.3.1 引物的筛选
• 5.3.2 遗传多样性
• 5.4 ISSR和EST两种标记的比较
• 5.5 马尾松种质资源的保护和利用
• 参考文献
• 附录A.部分ISSR PCR扩增图像
• 附录B.部分EST-SSR PCR扩增图像
• 致谢