论文摘要
鸡传染性法氏囊病（Infectious Bursal Disease，IBD）是危害雏鸡的一种急性、高度接触性、病毒性传染病，给世界范围的养鸡业造成巨大经济损失。病原为鸡传染性法氏囊病病毒（Infectious Bursal Disease Virus IBDV），IBDV对宿主淋巴细胞有严格嗜性，其RNA基因组易变异，常规的疫苗设计策略难以产生理想的免疫效果，因此，探索防治该病的新方法有重要意义。RNA干扰（RNA interference，RNAi）作为新的有效抗病毒工具，其机制与建立在病毒蛋白基础上的传统的疫苗免疫机制不同，是转录后mRNA水平上的基因沉默机制，通过双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）分子阻断或者降低同源基因的表达而达到抗病毒复制的效果。在哺乳动物细胞中，21～23nt的小干扰dsRNA（small interfering RNA，siRNA）可以诱导同源基因特异表达抑制，为探索抗病毒研究提供了新思路。本研究针对IBDV中RNA聚合酶（VP1）的编码基因、主要结构蛋白VP2、VP3的编码基因，使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具，分别选取3个特异siRNA序列（VP1：siRNA618、siRNA1115和siRNA2571，VP2：siRNA989、siRNA1143和siRNA1311，VP3：siRNA222、siRNA314和siRNA448），同时设计无相关序列（siRNA-CON）对照，利用体外转录法产生siRNA。VP1-siRNA、VP2-siRNA、VP3-siRNA转染Vero细胞后感染IBDV，通过病毒蚀斑和荧光定量PCR法检测VP1-siRNA对IBDV复制的抑制效果。VP2-siRNA、VP3-siRNA与表达绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的重组质粒pEGFP-VP2、pEGFP-VP3共转染Vero细胞，荧光显微镜下检测表达GFP蛋白细胞比例，快速筛选有效VP2-siRNA、VP3-siRNA片段，通过病毒蚀斑和流式细胞仪分析抑制效果，验证了筛选片段的基因沉默效果。本研究为RNAi技术应用于抗IBDV感染研究奠定了基础并为研究病毒蛋白功能提供了新途径。