论文摘要
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）感染是全球性公共卫生问题,影响超过2亿人。慢性乙肝病毒感染大大增加了肝硬化和肝细胞癌（HCC）的风险,80-90%的肝癌患者由乙肝病毒感染引起。虽然自1982年有高效的乙肝病毒疫苗问世,但仍有超过4.0亿慢性携带者,且75%的携带者居住在亚洲太平洋地区。根据HBV本身的变异情况被分为不同的基因型。越来越多的临床和流行病学观察表明,不同的基因分型存在不同的生物学和临床的表现。与同为肝炎病毒的丙型肝炎病毒（HCV）相同,HBV持续存在和发展会演变为慢性肝病。但HCV感染的基因分型已成为治疗的重要提示,而HBV的基因型在抗病毒治疗中起到的作用仍然知之甚少。对于HBV基因型与药物反应性的问题,似乎还更加复杂,目前基因型与干扰素的联系是较为清楚,而核苷（酸）类似物与基因型看起来确没有什么联系。但越来越多的研究表明HBV基因型对于慢性乙肝病毒的感染的治疗和预后有影响,而在中国大约有95%的人群感染的基因型为B、C型。因此我们需要建立一种迅速、高效和高灵敏度,并能对B和C基因型分型和定量的手段,动态地监测基因型和HBV-DNA水平变化来寻找核苷（酸）类似物与HBV基因型之间的联系。目的:乙型肝炎病毒（HBV）是人类慢性肝脏疾病的重要原因,是一个重大的公共卫生问题。病毒载量和HBV基因型在确定明确临床疗效,反应及乙肝患者抗病毒治疗上扮演关键角色。目前对于病毒基因型检测和病毒DNA的定量检测不能同时完成。我们想建立一种新的迅速、高效和高灵敏度的方法来同时对HBV的基因型B和C分型并定量。并用该方法监测慢乙肝患者在ADV用药48周过程中HBV B和C基因型的变化,以明确核苷（酸）类似物与HBV基因型之间的联系。方法:在本研究中,同时定量和基因分型的方法建立在实时定量PCR技术的基础上,能够一次反应同时对HBV B和C基因型进行分型并定量。对基因型B和C的RT区型,根据型间特异、型内保守的原则,设计了特异性的引物和探针。最终获得能够对基因型B和C准确定量分型,并且没有交叉反应的方法。该方法对于混合感染的检出率要明显高于直接测序法。我们用该方法纵向研究了98位阿德福韦（ADV）治疗48周的慢乙肝患者基因型及病毒载量的变化。患者中53位慢乙肝患者有（0, 4, 8, 12, 24, 36和48周）7个时点的样本,其余45位有(（0, 8, 12, 24和48周）5个时点的样本。结果:在ADV治疗起始时,基因型的分布为:68.37% （67/98）的B型,10.20% （10/98）的C型和21.43% （21/98）的B/C混合型。经过48周的治疗后,除一位患者的HBV-DNA低于检测下限外,其余患者基因型的分布为:80.41% （78/97）的B型,15.59% （19/97）的B、C混合型。所有的感染单一基因型C的患者,基因型（100% [10/10]）均发生了改变,而仅有10.61% （7/66）的单一B型感染患者发生改变。14个B/C型混合感染的样本中,在48周的时其中有10个样本变成了单一的基因型B。另外,感染单一基因型C与单一基因型B和混合基因型B/C的患者相比,有更高的e抗原血清学转化率（70.00% [7/10]）,并且80.00%（8/10）的患者HBV-DNA拷贝数下降大于10的2次方。在整个48周的治疗过程中,有32为患者发生了基因型的改变（32.99%, 32/97）,而在整个治疗过程中曾出现过的基因型的患者共有38位,占38.78%。结论:本研究提供了一个经济、快速、可靠的基因分型和定量的新方法,能够提供病毒载量和基因型的连续检测,适合应用于亚洲人群病程监控,且对于基因型混合的检出率高。借助已经建立的准确、可靠的HBV定量和分型的方法,探讨了基因型对抗病毒药物的敏感性。发现基因型C比基因型B对ADV的治疗更加敏感,表现在基因型的改变,血清学转化及HBV-DNA水平下降等方面。还发现在抗病毒治疗过程中基因型的改变是普遍存在的。并且基因型混合的比例也比想象的更高。提示在将来临床抗病毒治疗中,慢乙肝患者乙肝病毒基因型的鉴定也是相当重要的。