基于激光拉曼镊子和红外光谱技术分析生物材料的应用研究

论文摘要

拉曼光谱和红外光谱都属于分子振动光谱的范畴,两者在某种程度上存在互补的关系,但是在产生机理有本质的差别,拉曼光谱是由分子对光的散射效应引起的,红外光谱是分子对入射光的吸收而产生的。近几十年来,二者作为光谱学分析方法得到了广泛的应用,并且逐渐发展了一些相关的光谱学检测技术。激光镊子拉曼光谱技术,简称激光拉曼镊子,是结合光镊与显微拉曼光谱技术的一种光学技术,它利用同一束光来实现囚禁单个悬浮细胞并激发细胞分子的拉曼光谱,消除普通显微拉曼光谱技术将细胞固定在玻片上所引起的不良影响,并获得信噪比更高的光谱,是研究生物质分子结构的有用工具,也是目前单细胞分子水平研究的热门工具；红外光谱技术已发展较为成熟,具有快速、准确、无损的优点,红外光谱法现已广泛地应用在中草药质量的定性和定量分析。本文着重介绍激光拉曼镊子分析类胡萝卜素合成和红外光谱技术在中药产地鉴别的应用研究,这两个领域的主要研究内容如下：本文内容一共八章。第一章,激光拉曼光谱及类胡萝卜素概述,分别简单介绍了拉曼光谱、激光光镊拉曼光谱系统、拉曼光谱数据处理方法,类胡萝卜素的概述以及国内外的研究背景。第二章,利用拉曼镊子优化适宜红酵母生成类胡萝卜素的发酵培养基,结果显示,对于不同氮源、碳源的培养基,红酵母细胞合成的类胡萝卜素的含量明显不同；线性拟合结果显示紫外光谱法所得数据和拉曼峰高数据有良好的相关性；定量分析拉曼峰高,得出酵母粉十胰蛋白胨和葡萄糖分别是适宜的氮源和碳源。第三章,利用拉曼镊子监测红酵母细胞发酵合成类胡萝卜素的动态过程,在细胞水平上,揭示类胡萝卜素的积累规律和合成机制,同时获取其它生物大分子如核酸、脂类的信息,实验结果显示,类胡萝卜素和脂类的合成大多集中在细胞生长的后指数时期和稳定期,因为在这两个时期,细胞由于缺乏营养生长受到抑制,同时,核酸的浓度变化趋势是先增加然后减小,类胡萝卜素的浓度随着核酸浓度的变化而变化。第四章,本章注重研究红酵母色素,首先通过超声波技术提取类胡萝卜素,然后利用薄层层析技术分离红酵母色素,最后采用紫外可见光谱法和拉曼光谱法鉴定色素,结果如下,薄层层析法能较好的分离红酵母色素,方法简单、快捷,对分离出的组分进行紫外可见扫描及拉曼光谱分析,初步鉴定为红酵母细胞至少能合成3种色素。其中一种是p-胡萝卜素,其余的可能是圆酵母素和红酵母红素,紫外扫描结果显示,B-胡萝卜素的最大吸收峰为450 nm,圆酵母素在496 nm和525 nm处有最大吸收峰,红酵母红素的最大吸收峰是495 nm,分析这几种色素的拉曼光谱可以得出,不同色素分子结构C=C拉曼振动峰位不同,红酵母红素和圆酵母素的含量占有较大比例,此外,其峰高比值也有不同,也可以作为鉴定不同色素的一个指标。第五章,红外光谱技术概述,简述红外光谱的基本原理、傅里叶变换红外光谱仪、红外光谱试样制备技术以及红外光谱在中药领域的研究背景。第六章,红外光谱法结合主成分分析模型鉴别不同产地中药黄柏,建立PCA模型,对6种不同产地的黄柏的傅里叶变换红外光谱进行了主成分分析,结果显示,样本在主成分空间中聚集成为6个不同的类别,基本实现不同产地黄柏的鉴别,而且样本的疏密度在-定程度上反映了样本间亲缘关系。此外,提取主成分分析载荷因子,得出6种不同产地黄柏的差异主要体现在蛋白质、糖类、脂类、生物碱类、黄柏甾醇类、黄柏内酯、黄柏酮、黄柏酮酸这8种成分的含量不同。第七章,化学计量学结合红外光谱评价道地药材何首乌的品质。本章研究建立PCA模型,结果显示,三个主成分的累积贡献率达到98%,样本在主成分空间中聚集成为4个不同的类别,基本实现不同产地何首乌的鉴别。提取模型的载荷因子,分析显示,4个产地何首乌的差异主要在芳香族化合物、草酸钙、磷脂、糖蛋白、多糖和苷类共6种化学成分上体现；最后利用SIMCA方法判别未知样本的归属,对不同产地未知何首乌样本判断准确率均为100%,实现对不同来源未知样本的识别。因此,本研究建立的PCA鉴别和SIMCA识别模型是合理的,具有较强的区分和识别能力,可以作为一种快速鉴别和评价何首乌的方法。第八章,结论与展望,总结了硕士阶段的研究工作,指出了本文研究的意义和不足之处,对以后的工作进行了展望。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 拉曼光谱及类胡萝卜素概述
• 1.1 拉曼光谱概述
• 1.1.1 拉曼光谱的基本原理
• 1.1.1.1 拉曼散射的波动性理论
• 1.1.1.2 拉曼散射的量子理论
• 1.2 激光拉曼光镊光谱系统
• 1.3 拉曼光谱数据处理方法
• 1.3.1 基于拉曼光谱信号处理的常用预处理方法
• 1.3.1.1 基线校正
• 1.3.1.1.1 导数
• 1.3.1.1.2 曲线拟合
• 1.3.1.1.3 小波变换
• 1.3.1.2 归一化方法
• 1.3.2 复合预处理方法
• 1.3.3 基于化学计量模型的拉曼光谱处理
• 1.3.3.1 主成分分析模型
• 1.3.3.2 偏最小二乘法模型
• 1.3.3.3 聚类分析模型
• 1.3.3.4 目标因子分析模型
• 1.3.3.5 人工神经网络模型
• 1.3.3.6 支持向量机模型
• 1.4 类胡萝卜素概述
• 1.4.1 类胡萝卜素的结构及功能
• 1.4.1.1 类胡萝卜素的结构
• 1.4.1.2 类胡萝卜素的功能
• 1.4.2 类胡萝卜素的生产方法及合成途径
• 1.4.2.1 植物提取法
• 1.4.2.2 化学合成法
• 1.4.2.3 微生物发酵法
• 1.4.2.4 类胡萝卜素生物合成途径
• 1.4.3 类胡萝卜素的常用分析方法
• 1.4.3.1 传统分析方法
• 1.4.3.2 拉曼光谱法
• 1.5 类胡萝卜素的研究背景及主要研究内容
• 1.5.1 研究背景及意义
• 1.5.2 拉曼镊子分析类胡萝卜素的主要研究内容
• 第二章 拉曼镊子优化红酵母合成类胡萝卜素
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料与方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 拉曼镊子系统
• 2.2.3 拉曼光谱检测与数据处理
• 2.2.4 紫外光谱法测定类期萝卜素含量
• 2.2.5 菌体发酵密度和生物量的测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 红酵母细胞的拉曼光谱及各峰归属
• 2.3.2 不同培养条件发酵的细胞平均拉曼光谱
• 2.3.3 紫外光谱法和拉曼检测的相关性分析
• 2.3.4 不同培养基对类胡萝卜素合成及产量的影响
• 2.4 本章小结
• 第三章 拉曼镊子分析红酵母生成的类胡萝卜素
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 细胞培养及处理
• 3.2.2 实验装置及拉曼检测
• 3.2.3 β-胡萝卜素标准曲线的制作
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 红酵母细胞内类胡萝卜素的定量分析
• 3.3.2 类胡萝卜素的动态变化过程
• 3.3.3 拉曼镊子与传统高效液相色谱法的对比
• 3.3.4 单细胞分析技术的重要性
• 3.4 本章小结
• 第四章 红酵母色素的分离及测定
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 主要仪器
• 4.2.2 主要试剂
• 4.2.3 实验方法
• 4.2.3.1 薄层层析法分析和鉴定红酵母色素
• 4.2.3.2 展层和展开剂的选择
• 4.2.3.3 红酵母色素的紫外可见光谱分析
• 4.2.3.4 红酵母色素的拉曼光谱分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 薄层层析分析红酵母色素
• 4.3.2 紫外及可见光扫描及分析
• 4.3.2.1 红酵母色素的拉曼光谱分析
• 4.3.2.2 红酵母色素的峰高比值分析
• 4.4 结论
• 第五章 红外光谱技术概述
• 5.1 红外光谱的概述
• 5.1.1 红外光谱的基本原理及解释
• 5.1.2 产生红外吸收的条件
• 5.1.3 红外光区的划分
• 5.2 红外光谱仪介绍
• 5.2.1 红外光谱仪发展历程
• 5.2.2 傅里叶变换红外光谱仪
• 5.2.3 傅里叶变换红外光谱仪的优点
• 5.3 红外光谱法中的试样制备
• 5.3.1 固体试样的制备
• 5.3.2 液体试样的制备
• 5.3.3 气体试样的制备
• 5.4 红外光谱技术分析中药的现状
• 5.5 红外光谱法鉴别中药的研究内容
• 第六章 红外光谱结合主成分分析法鉴别不同产地黄柏
• 6.1 引言
• 6.2 实验部分
• 6.2.1 仪器设备及试剂
• 6.2.2 样本处理与制备
• 6.2.3 红外光谱测定及数据处理
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 不同产地黄柏的平均红外光谱
• 6.3.2 不同产地黄柏的红外光谱差异
• 6.3.3 主成分分析模型鉴别不同产地黄柏
• 6.3.4 主成分分析鉴别模型载荷因子分析
• 6.4 本章小结
• 第七章 红外光谱结合化学计量学评价不同产地何首乌
• 7.1 引言
• 7.2 实验部分
• 7.2.1 材料来源及处理
• 7.2.2 光谱收集及预处理
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 不同产地何首鸟的平均红外光谱分析
• 7.3.2 主成分分析模型鉴别不同产地何首乌
• 7.3.3 主成分分析鉴别模型载荷因子分析
• 7.3.4 SIMCA预测模型
• 7.4 本章小结
• 第八章 总结与展望
• 8.1 论文总结
• 8.2 进一步研究的展望
• 8.2.1 拉曼镊子研究类期萝卜素的展望
• 8.2.2 红外光谱技术研究中药的展望
• 参考文献
• 硕士研究生期间所发表的论文以及参与或申请的课题
• 致谢