论文摘要
勃起功能障碍（erectile dysfunction, ED）是一种由多种原因共同作用而导致的阴茎海绵体内血流充盈不足,阴茎不能正常勃起或不能维持进行满意性交的疾病。1993年美国国立卫生研究院（National Institutes of Health, NIH）正式将ED定义为：阴茎持续不能勃起和（或）不能维持勃起,以达到满意性生活,病程满三个月以上。ED是男性的一种常见病,随着我们生活水平的提高,ED目前越来越受到人们的关注。流行病学的调查显示,当前全球大约有1.52亿男性正遭受到ED的困扰,特别是45岁以上的男性,他们患ED的风险性明显增高。专家预计,等到2025年全球将会有3.22亿男性罹患ED。糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是一种由多种病因共同引起的代谢紊乱性疾病,其主要特点是慢性高血糖,并伴有胰岛素分泌不足或作用障碍,导致碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱,最终造成多种器官慢性损伤、功能障碍或衰竭。目前糖尿病患者遍布全球各地,发病率日益增高。随着社会现代化,人口老龄化的发展,其发病率增高的趋势变得更加明显,糖尿病已成为21世纪全球性的重大公共健康间题。糖尿病与ED的发生关系十分密切,ED是糖尿病的常见并发症。流行病学调查显示糖尿病患者的ED发病率是普通人群的2～5倍。WHO的报告指出,约有50%～75%的糖尿病病人患有不同程度的勃起功能障碍。糖尿病性勃起功能障碍（diabetes mellitus induced erectile dysfunction, DMED）病程长而复杂,发病机制至今尚未完全阐明。我们知道阴茎的正常勃起是由于阴茎海绵体内流入的动脉血增多,而流出的静脉血减少,阴茎海绵体平滑肌舒张,使得阴茎海绵窦内血流量增多,海绵体内压力升高而产生的。因此任何影响阴茎充血及阴茎海绵体平滑肌舒张的病理过程均可以导致ED的发生。DMED主要是由于糖尿病对阴茎海绵体的器质性损害及患者社会心理因素共同作用而导致的。目前对DMED发病机制的研究主要集中在糖尿病状态下的器质性损害方面,如糖尿病对阴茎血管、神经、海绵体平滑肌等的损害,但随着医疗模式的改变,社会心理因素也渐渐开始引起人们的注意。生物信息学（Bioinformatics）是一门研究采集、处理、储存、传播、分析生物信息并对其进行解释的学科,它是由现代生物学、医学、信息学、计算机学、生物统计学及数学等学科相互渗透,高度交叉而形成的一门新兴前沿交叉学科,刚开始常被人们称为基因组信息学。它的主要任务是检索、获取、加工、储存、管理、分配、分析和解读生物学实验信息,它综合运用数学、计算机学和生物学等工具学科,其主要目的就是为了解读实验数据中所蕴含的生物学意义。高通量基因芯片技术的发展与广泛应用,导致了海量的基因表达谱数据的产生,而生物信息学的发展又为储存、处理、分析和整合这些庞大的数据信息提供了强大的技术支持。生物信息学和基因芯片技术的迅速发展与应用,给我们研究DMED的发病机制开阔了新的思路。如今利用生物信息学分析、分析基因芯片中的海量数据,以得到与疾病相关的基因并分析其功能已经成为了生命科学研究领域的热点。我们本次研究使用基因芯片数据分析软件GeneSifter对5个糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎组织和5个正常大鼠阴茎组织基因芯片数据进行生物信息学分析,了解与DMED相关的基因及其功能,初步探讨其相应的分子机制,为进一步的实验研究提供理论依据,并通过实验初步在细胞学水平上验证CCSMC凋亡在DMED发病机制中的作用,同时利用生物信息学方法简要分析其引起DMED的可能机制。本研究主要分为三章。第一章：生物信息学和基因芯片数据分析概述。在本章我们详细介绍了生物信息学、基因芯片、GEO数据库、目前常用的基因芯片数据分析软件及其相关应用等内容。生物信息学是一门应用计算机及信息技术开发出新的算法和统计学方法,然后对生物实验数据进行分析,挖掘实验数据所蕴涵的生物学意义,并通过开发新的数据分析工具获取和管理各种信息的学科。生物信息学是当今生命科学重大前沿领域之一,同时也将是21世纪生命科学的核心领域之一。基因芯片也称DNA微阵列芯片,是指将许多特定的寡核苷酸片段或cDNA片段作为探针并规律地将其排列并固化于支持物上,然后再按碱基配对的原理将其与样品中标记好的基因进行杂交,再通过荧光检测系统等对芯片进行扫描,并对每一探针上的荧光信号强度作出比较和检测,从而迅速得出所要的信息。基因芯片技术在发现新基因及分析各个基因在不同时空表达方面是一项十分有用的技术,它具有样品用量极少,自动化程度高等独特优点,便于我们大量筛选新的基因。基因表达数据库（Gene Expression Omnibus, GEO）是由美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI）在2000年创建的,它是目前全球最大的并且是完全公开的高通量基因表达谱数据库,它所储存的主要是基因表达谱数据和阵列杂交等数据。我们将样品与基因芯片杂交后,得到一系列不等的荧光强度信号,经扫描仪扫描后,荧光强度信号由扫描仪安装的芯片数据提取软件提取数据,转为计算机能识别的基因芯片数据,获得的基因芯片数据再用数据分析软件分析就能得到相关的生物学知识。本研究所使用的在线基因芯片数据分析软件GeneSifter就属于此类基因芯片分析软件。第二章：本章我们使用基因芯片数据分析软件GeneSifter对5个糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎组织和5个正常大鼠阴茎组织的基因芯片数据进行生物信息学分析,挖掘它们当中与DMED发病相关的基因及其功能,初步探讨其相应的分子机制,为DMED进一步的实验研究提供理论依据,本章还以本研究所使用的从GEO数据库中下载的GSE2457数据集（正常大鼠阴茎组织和DMED大鼠阴茎组织样本基因表达谱）为例,详细介绍了基因芯片数据分析的一般流程。DMED的发病过程中包含了许多种信号分子或蛋白的变化,而这些信号分子或蛋白的变化是由其相应基因的改变而引起的,因此我们可以使用芯片数据分析软件筛选DMED病程中差异表达的基因来分析与之所对应的信号分子或蛋白的变化,进而分析它们参与的生物过程及信号通路,这样便为我们研究DMED的发病机制提供分子生物学方面的理论依据,开阔了我们的研究思路。本研究使用在线基因芯片数据分析软件GeneSifter对5个DMED大鼠阴茎组织和5个正常大鼠阴茎组织基因芯片数据进行分析,结果共筛选得到661个差异表达的基因,其中表达上调的基因有280个,表达下调的基因有381个。GO分析及KEEG通路分析发现：表达上调的Kruppel-like factor 5 （klf5）基因在调控平滑肌细胞表型转化上起重要作用,它表达上调可能会通过引起平滑肌细胞表型转化而使平滑肌细胞功能紊乱进而导致ED；表达上调的Ceruloplasmin （cp）基因与调控血管内皮细胞舒张有关,它编码的铜蓝蛋白（CP）可能通过抑制内皮细胞型一氧化氮合酶（eNOS）和神经元型一氧化氮合酶（nNOS）两条途径减少NO的合成,引起阴茎供血血管舒张障碍,导致ED发生；表达下调的Collagen基因编码白膜的胶原纤维,其表达下调可能导致白膜中胶原纤维的含量和结构发生变化,引起白膜功能紊乱而导致ED；表达下调的bag基因属于Bcl-2家族,是一种抗凋亡基因,它表达下调可能引起CCSMC凋亡增多,引起CCSMC减少,导致阴茎海绵体收缩与松弛功能受限而引起ED。第三章：DMED大鼠CCSMC凋亡的研究。我们在上一章糖尿病性勃起功能障碍大鼠阴茎组织基因表达谱芯片数据分析的研究中发现CCSMC凋亡可能与DMED的发病有关。在本章研究中,我们通过检测正常大鼠与DMED大鼠CCSMC的细胞凋亡率探讨了CCSMC凋亡在DMED发病机制中的作用。从实验结果不难看出,DMED大鼠CCSMC凋亡明显多于正常大鼠,这提示了我们在糖尿病状态下CCSMC凋亡速度增多,引起CCSMC减少,导致阴茎海绵体收缩与松弛功能受限,进而引起ED,这可能是DMED的重要发病机理。结合生物信息学研究结果我们推测：在糖尿病状态下,机体产生了大量的氧自由基,特别是ROS,它通过JNK、p38信号传导通路激活生长因子受体,引起Ras-Raf-ERK通路的激活,启动Caspase依赖的细胞凋亡过程,诱导细胞凋亡,导致CCSMC数目减少,使得阴茎海绵体舒缩功能障碍,最终导致了ED的发生。但其精确的调控机制目前还不清楚,还有待进一步的实验研究。通过对DMED大鼠阴茎组织和正常大鼠阴茎组织全基因表达谱芯片数据的分析,我们筛选出了一些新的差异表达基因,这些基因的功能与阴茎白膜、CCSMC、血管内皮功能有关,开阔了我们进一步研究DMED的思路,虽然其相关生物学解释还需进一步分析及相关实验验证,但它为DMED发病机制的研究提供一些分子生物学方面的理论依据,为我们进一步的研究奠定了基础。