瑞氏木霉T-DNA插入筛选纤维素降解突变株及液泡蛋白分选受体基因功能研究

论文摘要

瑞氏木霉（Trichoderma reesei）是一种能够降解纤维素、半纤维素等复杂基质的具有重要经济价值的工业丝状真菌,长期以来用于生产纤维素酶、半纤维素酶和蛋白酶等多种酶类。同时,瑞氏木霉具有良好的分泌胞外蛋白（酶类）的能力和真核生物蛋白修饰加工机制,也成为异源蛋白表达的良好宿主。目前,在纤维素乙醇生产的过程中,纤维素酶活力和产量是制约纤维素乙醇生产的主要瓶颈,筛选纤维素酶高产菌株一直备受重视。同时,在纤维素酶分泌过程中的蛋白转运途径是控制大量纤维素酶成功输出的重要环节。因此,建立有效的分子突变技术将有助于快速筛选高产纤维素酶的突变菌株,而研究蛋白分泌途径的特定靶标基因功能将有助于鉴定纤维素酶运输分泌过程的关键调控因子。农杆菌介导的T-DNA插入突变技术具有转化效率高、遗传稳定性好、随机单拷贝插入等特点,一次转化可获得大量转化子,是进行大规模突变菌株筛选的有力方法。而最近发展起来的丝状真菌基因打靶技术在基因功能研究及菌株遗传改造方面,发挥着越来越重要的作用。因此,建立方便高效的农杆菌介导的瑞氏木霉T-DNA插入突变系统,获得瑞氏木霉的突变体库,可快速筛选纤维素降解能力提高的菌株。而利用基因打靶技术研究蛋白分泌途径的重要基因的功能有利于了解纤维素酶分泌输出的机制。本文采用新型抗生素为标记着眼建立高效率的瑞氏木霉T-DNA插入突变体库筛选纤维素降解突变菌株,并利用基因打靶技术研究蛋白分泌途径中的液泡蛋白分选受体vps10基因试图了解纤维素酶在分泌过程中的运输机制。本文以抗硫胺素（ptrA）为标记,利用农杆菌EHA105成功介导转化了瑞氏木霉纤维素酶高产菌株Rut-C30。首先,将来自于质粒T-ptrA的抗硫胺素（ptrA）表达盒插入到Ti质粒pCAMBIA0390中,构建了双元载体pCTA。然后,将该双元载体导入农杆菌EHA105后,与瑞氏木霉孢子共培养,在含抗硫胺素平板上筛选抗性转化子。通过PCR验证,表明T-DNA上的ptrA基因已插入到瑞氏木霉转化子染色体中。利用纤维素平板初步筛选转化子,得到纤维素降解能力变化的菌株30余株；然后,进一步利用液体发酵进行纤维素酶活力测定,得到纤维素酶活分别有不同程度提高的转化子2株和酶活力高峰提前的菌株1株。试验结果说明农杆菌介导的T-DNA插入突变技术可用于大规模筛选获得具有不同性状的突变菌株,该技术也是筛选瑞氏木霉纤维素降解突变菌株,深入了解瑞氏木霉纤维素酶合成和分泌机制的有效方法。为研究瑞氏木霉液泡蛋白分选受体vps10基因的功能,木文从瑞氏木霉基因组数据库中进行Blast查找到vps10基因序列,然后根据DNA序列设计引物,构建了vps10基因敲除盒Pvps10-pirA-Tvps10。利用原生质体转化法构建了瑞氏木霉vps10基因缺失菌株QM-△VPS10,并对缺失菌株进行了生长和产酶分析。实验结果表明,基因缺失菌株的生长状态与野生型菌株基本一致,生物量略有提高,对纤维素酶的分泌影响不显著,实验结果显示vpsl0基因敲除对瑞氏木霉野生型菌株QM9414的蛋白分泌没有显著影响,但据文献报道该基因敲除有可能对具有高表达外源蛋白的基因工程菌株有作用。另外,本文以瑞氏木霉△tku70菌株为出发菌株,构建了木聚糖酶Ⅰ缺失菌株△XYN1,研究了木聚糖酶Ⅰ缺失对菌株产纤维素酶的影响。实验结果显示：木聚糖酶Ⅰ缺失突变株木聚糖酶活力显著降低,胞外蛋白总量也有所降低。对其纤维素酶活力进行测定发现,其FPA活力在培养过程中有所降低,尤其是其pNPG和pNPC酶活力显著下降。该菌株的构建有利于阐明半纤维素酶和纤维素酶基因表达之间的相互影响,并进一步了解其作用机制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 绪论
• 1.1 瑞氏木霉概述
• 1.2 丝状真菌转化系统
• 1.2.1 丝状真菌转化方法
• 1.2.2 丝状真菌遗传转化系统的选择标记
• 1.2.3 丝状真菌遗传转化载体
• 1.3 农杆菌介导转化（AMT）丝状真菌研究进展
• 1.3.1 农杆菌介导的转化技术概述
• 1.3.2 农杆菌介导转化的双元载体
• 1.3.3 农杆菌介导真菌转化的优点
• 1.4 基因打靶技术及在丝状真菌基因功能研究中的应用
• 1.4.1 基因打靶技术
• 1.4.2 丝状真菌高效基因打靶技术研究现状与进展
• 1.5 丝状真菌蛋白分泌调控机制
• 1.5.1 蛋白分泌一般途径
• 1.5.2 液泡蛋白分选受体VPS10基因功能研究
• 1.6 瑞氏木霉的纤维素酶系
• 1.7 本文主要研究内容
• 第二章 瑞氏木霉T-DNA插入筛选纤维素降解突变株
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 培养基和培养条件
• 2.1.3 菌种保藏技术
• 2.1.4 主要分子实验试剂
• 2.1.5 重组DNA技术
• 2.1.6 引物设计及PCR扩增条件
• 2.1.7 双元载体pCTA的构建
• 2.1.8 农杆菌感受态细胞的制备与转化
• 2.1.9 农杆菌介导的瑞氏木霉转化
• 2.1.10 瑞氏木霉染色体提取
• 2.1.11 纤维素平板初步筛选纤维素降解能力突变株
• 2.1.12 纤维素降解突变株酶活力测定
• 2.2 实验结果和讨论
• 2.2.1 双元载体pCTA的构建结果
• 2.2.2 双元载体pCTA转化农杆菌EIIA105
• 2.2.3 农杆菌介导的瑞氏木霉转化
• 2.2.4 瑞氏木霉AMT转化子的分子验证
• 2.2.5 纤维素平板初步筛选纤维素降解突变株
• 2.2.6 纤维素降解突变株纤维素酶活力测定
• 2.3 本章小结
• 第三章 液泡蛋白分选受体VPS10基因功能研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 主要试剂及培养基
• 3.1.3 本章所用引物
• 3.1.4 瑞氏木霉vps10基因鉴定
• 3.1.5 vps10基因敲除载体的构建过程
• 3.1.6 瑞氏木霉的遗传转化
• 3.1.7 瑞氏木霉转化子的筛选
• 3.1.8 瑞氏木霉转化子染色体DNA的提取
• 3.1.9 瑞氏木霉转化子的分子验证
• 3.1.10 瑞氏木霉生长量的测定
• 3.1.11 瑞氏木霉转化子的纤维素酶活力及胞外总蛋白含量测定
• 3.2 实验结果与讨论
• 3.2.1 vps10基因敲除载体构建结果
• 3.2.2 瑞氏木霉的转化和vps10基因敲除转化子的筛选
• 3.2.3 T.reesei转化菌株QM-△VPS10性质测定
• 3.3 本章小结
• 第四章 瑞氏木霉纤维素酶系改造之木聚糖酶Ⅰ的敲除研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株及质粒
• 4.1.2 主要试剂及培养基
• 4.1.3 本章所用引物
• 4.1.4 瑞氏木霉xyn1基因鉴定
• 4.1.5 瑞氏木霉xyn1基因敲除载体构建
• 4.1.6 瑞氏木霉的遗传转化及转化子筛选
• 4.1.7 瑞氏木霉转化了分了验证
• 4.1.8 瑞氏木霉转化子的纤维素酶活力测定及胞外总蛋白含量测定
• 4.2 实验结果与讨论
• 4.2.1 xyn1基因敲除载体构建结果
• 4.2.2 瑞氏木霉的转化和xyn1基因敲除转化子的筛选
• 4.2.3 AXYN1菌株酶活力及胞外蛋白量测定
• 4.3 本章小结
• 全文总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间已（待）发表的学术论文目录
• 学位论文评阅及答辩情况表