论文摘要
背景与目的:在生理条件下成年动物肝脏仅有0.0012%0.01%细胞在进行分裂增殖,而当肝脏受到毒物损伤或外科切除的时候,则表现出极强的再生潜能,但肝再生是一个特殊而复杂的过程。近年来在肝部分切除或化学性损伤动物模型中对于肝脏生长发育的调控机制进行了大量的研究,尤其是转基因和基因敲除小鼠动物模型的应用使肝再生的研究取得突破性进展促进了对肝再生的认识。肝部分切除后的肝再生是由剩余的肝叶增大直至恢复原肝的重量,一旦恢复到原肝的重量,细胞增殖即停止。而实质上这不是肝脏再生而是残余肝脏的代偿性增生过程。肝细胞的反应性增殖被认为是肝切除术后肝再生过程中最重要的因素。多数研究认为肝细胞增殖是肝再生的主要机制,而且主要集中在细胞周期的调节系统上。然而,细胞生长（cell growth）在肝再生过程中的作用并没有完全被揭示。细胞生长和细胞增殖是相互联系又相互区别的两个概念,细胞生长是细胞大小或者体积的增加,而细胞增殖则是由细胞分裂而使细胞数量的增多,它们在器官生长、组织形成及肿瘤生长中发挥重要作用。细胞生长与细胞增殖密切相关,细胞只有生长到一定大小才能分裂增殖,否则会越来越小。近年的研究表明,Akt/TSC1-TSC2/mTOR是一条进化保守的信号通路,广泛存在于果蝇、鱼类及哺乳动物体内。它在调节蛋白质合成、细胞生长、细胞增殖和肿瘤的发生发展等方面发挥重要作用。目前对于Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号通路在肝部分切除术后肝再生过程中的作用尚不清楚。我们考虑该信号通路可能在肝部分切除术后发挥着重要作用,故深入研究肝切除术后Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号通路的变化及其对肝细胞的影响,对探讨肝再生的机制具有重要的意义。本研究试图观察Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号通路对肝细胞再生的影响,从而证明该信号通路可能在肝再生过程中发挥着重要的作用,从另一个方面丰富肝再生的理论。本研究分为两个部分,首先采用Higgins等创建的经典大鼠肝部分切除模型行肝部分切除术,在不同时相点分离与培养肝细胞,观察磷酸化TSC2蛋白及磷酸化mTOR蛋白在肝部分切除术后肝细胞中的表达情况。然后观察该信号通路对肝细胞大小、蛋白质合成及细胞增殖周期的影响,从而探讨其在肝再生过程中起到重要的作用。方法:采用Higgins & Aderson创建的经典大鼠肝部分切除术模型,即分别于肝左叶、中叶根部结扎切除,计算大鼠肝切除率。在术后0h、2h、6h、24h、72h五个不同的时相点,分离肝细胞。肝细胞分离方法采用肝脏原位匀速加离体循环胶原酶灌注、Percoll离心方法,得到肝细胞沉淀。通过台盼蓝染色判断测定细胞活性,细胞计数,调整细胞浓度为（1.0-1.5）×106/ml。放入37℃、5%CO2培养箱中培养。预培养2h后每时相点分为三组培养:CO组（不加抑制剂组）、RA组（肝部分切除术后培养基中加入mTOR抑制剂Rapamycin）、TR组（肝部分切除术后培养基中加入Akt抑制剂Triciribine）。①细胞培养24h后,裂解细胞提取蛋白,采用western blot观察肝细胞中磷酸化mTOR及磷酸化TSC2的表达;②细胞培养20h后往12孔培养板的每孔加入3H-亮氨酸1uCi,继续培养4h后行3H-亮氨酸掺入率测定;③细胞培养24h后,分别收集细胞爬片,采用扫描电镜结合图形分析系统分析测定细胞横截面积;④细胞培养24h后,采用流式细胞分析仪检测细胞增殖周期的变化。结果:1.经过多次实验,平均每只鼠肝可获取1.21×108个肝细胞。经台盼蓝拒染实验测定细胞平均活性为96%。刚刚分离的肝细胞倒置显微镜下观察可见肝细胞呈单个分散状态,呈圆球形,细胞折光性强,接种4 h后肝细胞贴壁、伸展,连接成条索状;24 h后绝大多数肝细胞贴壁,呈扁平状、体积明显增大,连接成岛屿状;48h后肝细胞贴壁牢固,伸展为上皮样,连接成片。分离培养的细胞形态完全符合典型的肝细胞形态特征。2.肝细胞中磷酸化TSC2蛋白的含量由2h开始升高,在6h达到高峰（P<0.01）,24h有所降低;RA组磷酸化TSC2蛋白的含量和CO组磷酸化TSC2蛋白的含量有相似性的变化;而TR组磷酸化TSC2蛋白的含量在各时相点均为低水平表达,而且在各时相点之间变化趋势不甚明显。肝细胞中磷酸化mTOR蛋白的含量也由2h开始升高,6h达到高峰,24h降低,此和磷酸化TSC2蛋白的含量变化几乎一致。而RA组和TR组磷酸化mTOR蛋白的含量在各时相点均表现为低水平表达,在各时相点之间变化趋势也不明显。3.在术后0h、2h、6h和24h时相点,RA组和TR组肝细胞3H-亮氨酸掺入率分别与CO组相比较在统计学上有非常显著差异（P<0.01）。在72h时相点,CO组和RA组肝细胞3H-亮氨酸掺入率分别为:3287.6±476.0;2794.5±525.6,在统计学上有显著差异（P<0.05）,TR组为875±186.5,和CO组相比在统计学上仍有非常显著差异（P<0.01）。从组内比较看,CO组随时间的变化细胞3H-亮氨酸掺入率在持续增加,从术后2h即有变化,6h更为明显,但是24h到72h之间变化较慢,维持在较高水平;RA组与CO组具有相似性变化;而TR组术后3H-亮氨酸掺入率0h-72h一直保持在较低水平,变化不大。4.在术后2h和6h,RA组和TR组肝细胞横截面积分别与CO组相比有显著统计学差异（P<0.05）。在24h时相点,CO组359.72±106.46和RA组肝细胞横截面积分别为:363.38±153.38。在统计学上无显著差异（P>0.05）;而TR组为292.74±116.11,和CO组相比在统计学上仍有显著差异（P<0.05）。同时扫描电镜发现,CO组多见肝细胞接近完成细胞分裂,而RA组和TR组肝细胞则大部分还处在单细胞状态。从组内比较看,CO组2h时相点到6h时相点细胞横截面积在增加,6h时相点至24h时相点变化不大。RA组与CO组具有相似性变化;而TR组术后细胞横截面积均较小。5.与两个抑制剂组（TR组、RA组）相比,CO组G0/G1期细胞逐渐降低,S期和G2/M期细胞明显增加,在术后各个时相点与抑制剂组有明显差异（P<0.05或者P<0.01）,其高峰在术后24h,72h有明显降低。另外,RA组和TR组相比较只是在术后24h差异有显著性。结论:1.本实验所采用的肝脏原位匀速加离体循环胶原酶灌注加Percoll离心的方法,经济、方便、可靠,分离的肝细胞具有较高的活性和产率。2.大鼠肝部分切除术后早期即出现磷酸化TSC2表达增加,由2h开始升高,在6h达到高峰,24h有所降低,同时明显影响下游信号分子磷酸化mTOR的表达;提示Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号传导通路在肝切除术后早期即被激活。3.大鼠肝部分切除术后早期即被激活的Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号传导通路可以明显促进肝细胞的蛋白质合成和细胞生长。随着术后时间的延长,肝细胞3H-亮氨酸掺入率在持续增加,从术后2h升高,6h更为明显,24h到72h之间变化缓慢,维持在较高水平;从2h时相点到6h时相点肝细胞横截面积在增加,6h时相点至24h时相点变化不大。我们认为,这种促进肝细胞的蛋白质合成的作用一方面有利于机体的创伤修复,另一方面为肝细胞的分裂增殖奠定了物质基础。4.大鼠肝部分切除术后肝细胞明显处于增殖状态,G0/G1期细胞逐渐降低,S期和G2/M期细胞明显增加,在术后各个时相点对照组和抑制剂组有明显差异。这种增殖状态和Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号传导通路在肝部分切除术后早期激活密切相关。从而说明此通路在肝再生反应肝细胞增殖过程中起到重要的作用。总之,Akt/TSC1-TSC2/mTOR信号传导通路在肝切除术后早期即被激活,可以同时促进细胞生长和细胞增殖,在肝再生过程中发挥重要作用。深化对此信号通路以及细胞生长和细胞增殖间关系的研究将进一步丰富肝再生理论。