论文摘要
目的:本课题通过对铜绿假单胞菌野生株PAO1、菌毛突变株PAO-△pilHIJK以及密度感知（quorum sensing,QS）系统las和rhl基因缺失的双变异株PAO-JP2的生物学特性研究,比较缺铁与正常环境对铜绿假单胞菌耐药性、生物被膜形成能力、毒力因子表达等的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:应用菌落形态观察、Gram’s染色镜检、β-内酰胺酶鉴定、VITEK全自动微生物分析仪鉴定、原子力显微镜观察等方法对PAO1、PAO-△pilHIJK和PAO-JP2生物学特性进行鉴定比较;采用2,2′-联吡啶（DPD）为螯合剂建立体外缺铁环境模型;应用琼脂平板稀释法测定头孢他定、妥布霉素和环丙沙星3种抗菌药物在正常与缺铁环境下对菌株的MIC值;应用微量稀释法测定正常与缺铁环境下对菌株的MBEC值;应用MTT法测定正常与缺铁环境下3种抗菌药物对生物被膜内菌的杀菌活性;应用银染后光镜、扫描电镜、激光共聚焦显微镜观察在正常与缺铁环境中培养7日后PAO1、PAO-△pilHIJK和PAO-JP2生物被膜结构,并采用计算机图像处理系统对银染后的硅胶片生物被膜图像进行分析。应用针眼法测定不同铁离子环境对3株菌蹭行能力的影响;应用及酶-底物反应法观察铁离子对3株菌弹性蛋白酶的影响;应用SDS-PAGE方法观察铁离子对3株菌外毒素A的影响;利用荧光定量PCR定量分析缺铁环境对PAO1、PAO-ApilHIJK菌株lasR和rhlR基因转录影响。结果:PAO1菌落可见明显的脓绿素,而PAO-△pilHIJK和PAO-JP2未见;3株菌均为β-内酰胺酶阴性的革兰阴性杆菌;VITEK鉴定发现PAO1、PAO-△pilHIJK、PAO-JP2及ATCC27853标准株在细菌生化反应上存在细微的差异,但均鉴定为铜绿假单胞菌。原子力显微镜观察3株菌均为短杆状,从长度来比较,PAO1＞PAO-△pilHIJK＞PAO-JP2。DPD体外抑菌浓度实验发现DPD为500μM时对3株菌的正常生长未有影响。MIC结果显示,缺铁时浮游菌对药物的敏感性轻微下降。MBEC结果发现,妥布霉素在8MIC时,能够完全杀死被膜中菌;而头孢他定和环丙沙星在8MIC时无该效果。MTT法研究发现缺铁环境能够促进药物的杀被膜内菌的活性。银染法的图片和计算机图像分析结果展示了在缺铁环境中,PAO1、PAO-△pilHIJK和PAO-JP2形成的黑染交织物均显著减少;SEM结果显示,7日正常环境培养后PAO1形成成熟生物被膜,而在缺铁状态下只能形成散在小菌团;PAO-△pilHIJK在正常环境中呈多数小团块聚集状,但结构没有PAO1致密;缺铁时同PAO1类似,偶见散在小菌团。PAO-JP2正常情况下形成的被膜结构就很不典型,菌团小且稀疏、散在的细菌多;缺铁时仅可观察到少量单个菌体黏附在硅胶膜表面。CSLM观察发现PAO1形成的生物被膜为大块状隆起,而PAO-△pilHIJK表面为大量的小隆起;在缺铁情况下,PAO1的被膜仍呈片状分布,亮度和面积都明显减少,PAO-△pilHIJK则呈稀疏点状分布。蹭行能力考察发现缺铁环境能显著刺激具有Ⅳ型菌毛的PAO1和PAO-JP2蹭行运动活性,而适当加入铁离子能抵消该作用;对丧失了蹭行能力的菌毛突变株PAO-△pilHIJK的影响不大。在缺铁时PAO1和PAO-△pilHIJK弹性蛋白酶的表达量会显著增加,加入铁后部分恢复;铁浓度几乎对原本表达已经很少的PAO-JP2菌株的影响很小。缺铁环境是PAO1和PAO-△pilHIJK表达的外毒素A的必要条件;PAO-JP2则在任何情况下都没有外毒素A的表达。缺铁时PAO1菌株lasR和rhlR的表达均显著上调,而PAO-△pilHIJK缺铁时与正常时差别不大。结论:缺铁环境能轻微降低PAO1、PAO-△pilHIJK和PAO-JP2浮游菌对药物敏感性,但能够增加药物对成熟生物被膜菌的杀菌效果;缺铁环境能够增加3株菌弹性蛋白酶和外毒素A的表达;缺铁环境显著降低3株菌生物被膜形成能力,很可能是由于缺铁环境刺激具有Ⅳ菌毛菌株的蹭行能力和影响QS系统相关基因las和rhl基因的表达造成的。