陕西省苹果和葡萄炭疽病病原鉴定

论文摘要

苹果炭疽病作为一种世界性真菌病害,给农业生产造成严重的经济损失,因而引起研究者的普遍关注。一直以来,国内外研究者认为许多植物炭疽病都是由胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）引起的,尤其是胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）可侵染世界范围内1000余种植物。近年Cannon等通过研究将典型的胶孢炭疽菌从形态学和分子生物学角度进行准确定义,为炭疽菌的划分提供了主要依据,彻底改变了原本种的概念。此后,陆续有研究发现原来归属于胶孢炭疽菌的种其实不是真正意义上的胶孢炭疽菌,而是其它的种类。为明确发生在陕西省苹果、葡萄上炭疽菌的种类构成、归属,优势致病种群构成、分布及与寄主的关系,本研究通过采用综合多基因核苷酸序列系统学、形态学、致病性、培养特性等性状的多相分类技术,并通过SSR多态性技术分析菌株遗传多样性,对采自陕西省10个苹果和11个葡萄主要产区炭疽病病原进行了研究,结果如下:1.共采集标样400余份,采用组织分离法和直接挑取分生孢子法分离纯化得到100个苹果炭疽菌单孢菌株和98个葡萄炭疽菌单孢菌株,经致病性测定试验,验证其为炭疽病致病菌株。2.系统鉴定,首次发现苹果炭疽病可由为松针炭疽菌（Colletotrichum fioriniae）,果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）,海水仙炭疽菌（Colletotrichum hymenocallidis）和暹罗炭疽菌（Colletotrichum siamense）4种炭疽菌引起。其中,松针炭疽菌（C. fioriniae）、果生炭疽菌（C. fructicola）和暹罗炭疽菌（C. siamense）为国内新记录种;3.葡萄炭疽病可由4种炭疽菌引起,其中松针炭疽菌（C. fioriniae）与苹果炭疽病病原之一相一致,为首次在葡萄上发现,为国内新记录种。其余3个种被鉴定为新种,分别命名为降帐炭疽菌（Colletotrichum jiangzeis）、眉县炭疽菌（Colletotrichum meixiane）和葡萄炭疽菌（Colletotrichum vitise）,均为葡萄炭疽病的新病原。4.供试样品中未发现典型的胶孢炭疽菌和尖孢炭疽菌引起陕西苹果和葡萄炭疽病,与以往的研究结果不同。5.苹果和葡萄具有相同的炭疽病的病原种类,说明这些寄主在自然条件下可能作为相互的侵染来源。6.在近似种的分类鉴定过程中,多基因序列分析是一种有效的分子手段。它可以弥补rDNA-ITS信息量不足的缺点,提高近似种间界限区分力度。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 苹果炭疽病简介
• 1.2 葡萄炭疽病简介
• 1.3 炭疽病病原菌分类
• 1.3.1 炭疽菌属的分类
• 1.3.2 炭疽菌种的分类
• 1.3.3 国内炭疽菌属和种的分类研究
• 1.4 胶孢炭疽菌
• 1.5 尖孢炭疽菌
• 1.6 分子生物学技术在炭疽菌分类中的应用
• 1.6.1 常用的分子生物学技术
• 1.6.2 常用的分子生物学技术优缺点比较
• 1.6.3 各种分子标记在炭疽菌分类中的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 样本的采集
• 2.2 病原菌的分离和纯化
• 2.3 致病性测定
• 2.4 病原菌的形态鉴定
• 2.4.1 菌落形态观察和测定
• 2.4.2 分生孢子形态、大小观察和测量
• 2.4.3 附着胞的观察
• 2.5 病原菌的分子鉴定
• 2.5.1 试剂
• 2.5.2 仪器
• 2.5.3 主要溶液及培养基的配制
• 2.5.4 改良CTAB 法提取基因组DNA
• 2.5.5 rDNA-ITS 序列PCR 扩增
• 2.5.6 rDNA-ITSPCR 扩增产物测序
• 2.5.7 ITS 序列数据分析和系统树的构建
• 2.5.8 多基因序列PCR 扩增
• 2.5.9 多基因PCR 扩增产物测序
• 2.5.10 多基因序列数据分析和系统树的构建
• 2.6 苹果炭疽菌的SSR 引物设计和初步筛选
• 2.6.1 供试菌株
• 2.6.2 半简并引物扩增
• 2.6.3 目的片段的回收
• 2 法）'>2.6.4 感受态细胞的制备（0.1MCaCl₂法）
• 2.6.5 连接转化
• 2.6.6 菌落PCR 鉴定
• 2.6.7 质粒的提取
• 2.6.8 SSR 引物的设计和合成
• 2.6.9 SSR 引物筛选
• 第三章 结果与分析
• 3.1 标本的采集、分离和保存
• 3.2 致病性的测定
• 3.3 菌株的形态鉴定
• 3.4 菌株的分子鉴定
• 3.4.1 rDNA-ITS 序列PCR 扩增产物的检测
• 3.4.2 rDNA-ITS 系统发育树
• 3.4.3 多基因PCR 扩增产物的检测
• 3.4.4 多基因序列系统发育树
• 3.5 种类描述
• 3.5.1 果生炭疽菌Colletotrichum fructicola Prihastuti, L. Cai & K.D. Hyde，Fungal Diversity 39：96，国内新纪录种（图3-8）
• 3.5.2 暹罗炭疽菌Colletotrichum siamense Prihastuti, L. Cai & K.D. Hyde，Fungal Diversity 39：98，国内新纪录种（图3-9）
• 3.5.3 海水仙炭疽菌Colletotrichum hymenocallidis Y.L. Yang, Zuo Y. Liu, K.D. Hyde & L. Cai,Fungal Diversity 39：138（图3-10）
• 3.5.4 松针炭疽菌Colletotrichum fioriniae （Marcelino & Gouli） R.G. Shivas & Y.P.Tan，Fungal Diversity 39：117，国内新纪录种（图3-11）
• 3.5.5 眉县炭疽菌Colletotrichum meixiane R. Qin & R. Zhang, sp. nov.，新种(图3-
• 3.5.6 降帐炭疽菌Colletotrichum jiangzeis R. Qin & R. Zhang, sp. nov.，新种(图3-
• 3.5.7 葡萄炭疽菌Colletotrichum vitise R. Qin & R. Zhang, sp. nov.，新种(图3-
• 3.6 SSR 引物设计和初步筛选
• 3.6.1 半简并引物的扩增结果
• 3.6.2 半简并引物测序结果
• 3.6.3 SSR 引物设计结果
• 3.6.4 半简并引物筛选结果
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 标本的采集、分离和保存
• 4.1.2 病原学鉴定
• 4.1.3 多基因序列分析
• 4.1.4 SSR 引物设计
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介