转移蛋白酶抑制剂基因RNAi表达载体转化大豆的遗传变异研究

论文摘要

大豆是既是我国主要的粮食作物,又是主要的油料作物,具有极高的营养价值,是人类食物和动物养殖的主要植物蛋白来源。但是,大豆含有胰蛋白酶抑制剂、凝集素、脂氧化酶等营养抑制因子影响大豆品质。胰蛋白酶抑制剂是大豆蛋白质中最重要的一类抗营养因子,它在籽粒中的大量存在,会明显影响大豆食品与饲料的营养价值和食用安全。因此,培育低含量或不含胰蛋白酶抑制剂大豆品种具有重要的意义。但是采用常规的育种技术至今尚未能培育出令人满意的不含胰蛋白酶抑制剂大豆品种,而且进程极为缓慢。随着分子生物学技术的发展,通过基因工程的方法对大豆进行有目的的改良,是一种较常规育种更为有效、快速的方法,是现代生物技术在生产实践中的具体应用。RNA干扰（RNAi）是由同源性内源或外源dsRNA引起的序列特异性基因沉默现象,在动、植物和真菌中广泛存在并被证实。目前已应用RNAi技术在改善油脂的品质、改良淀粉品质、提高营养物质或降低有害物质含量、提高抗褐化能力、提高果实耐贮性、进行代谢调控以获得目的次生代谢物等方面进行了作物品质改良研究。作为一种下调表达技术,该技术在研究植物基因功能和改良作物品质等领域有良好的应用前景。本研究是课题组前期工作的继续和深入。本课题组为培育低含量或不含胰蛋白酶抑制剂的大豆新品种,已经克隆了大豆胰蛋白酶抑制剂基因,并构建了高效的RNAi表达体系,通过花粉管通道法将其导入大豆,以期抑制大豆胰蛋白酶抑制剂基因的表达。本研究在已经获得转基因植株T0代种子的基础上,继续研究胰蛋白酶抑制剂RNAi表达载体对转基因植株T1代大豆品质性状和农艺性状的影响,以期从变异后代中筛选出有突出优点:低含量或不含胰蛋白酶抑制剂,并且综合性状优良的新种质材料。取得如下结果:1、将转胰蛋白酶抑制剂RNAi表达载体的T0代种子第二年种下,对成株的200株大豆的幼嫩叶片分别提取基因组DNA,以35S启动子的序列为引物进行PCR扩增,结果从9株植株中得到830bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生。为进一步确定外源基因的整合情况,对PCR阳性植株进行PCR-Southern blot分析。结果表明,9株均有杂交带出现,而未经转化的植株没有杂交信号出现。证明外源基因已整合到基因组中。2、以T1代的大豆籽粒为材料,采用SDS聚丙烯凝胶电泳对胰蛋白酶抑制剂蛋白的表达进行了测定,结果显示,有5株转基因阳性植株的胰蛋白酶抑制剂蛋白的表达与相应的对照相比有明显的下降,说明外源基因的导入有效地抑制了胰蛋白酶抑制剂蛋白的表达。3、应用近红外谷物分析仪测定了转基因大豆种子的蛋白质和脂肪含量,并将测定结果与传统的凯氏定氮法和索氏提取脂肪法测定结果进行比较。结果表明:相同样品分别用两种分析方法的测试结果基本吻合,尤其是应用近红外谷物分析仪测定大豆脂肪含量结果准确度较高,与索氏提取脂肪法测定结果相比,偏差均小于2,最低偏差仅为0.04。以上结果说明近红外谷物分析仪的分析结果比较可靠,可以适用于大豆大批量育种材料筛选和非破坏性的品质鉴定工作。4、通过对获得的9株T1代转基因阳性植株和相应的对照植株的脂肪和蛋白质含量的测定,得到5株高脂肪含量的大豆变异株,脂肪含量最高的达到27.15%,说明只有这5株转基因阳性植株的RNA干扰构件有效地整合到基因组并成功地表达了siRNA,从而抑制了内源性胰蛋白酶抑制剂mRNA的翻译,使胰蛋白酶抑制剂蛋白的表达量明显降低。这5株植株分别是吉农18-32-1-1、吉农18-33-1-2、吉农18-35-1-1、美引1号-2-1-1和通农14-9-2-1。还得到了一株高蛋白的大豆变异植株通农14-6-10,蛋白质含量达到49.89%。5、通过对所有收获的T1代转基因植株和非转基因对照植株进行的室内拷种结果,得知9株T1代转基因阳性植株在农艺性状方面产生了不同类型,不同程度的变异。其中吉农18-32-1-1、吉农18-33-1-2、吉农18-35-1-1、美引1号-2-1-1和通农14-9-2-1的虫食粒比相应的对照品种增多,因为胰蛋白酶抑制剂对植株本身还有抗虫保护作用,所以虫食粒增多也进一步证明这5株转基因阳性植株的siRNA有效的整合到基因组中并成功的表达了siRNA,使胰蛋白酶抑制剂的表达下调,使转基因阳性植株产生了变异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 大豆蛋白酶抑制剂的研究现状
• 1.2 RNAi在作物品质改良中的研究进展
• 1.3 转基因植物中外源基因的整合、遗传、表达及鉴定
• 1.4 本研究的目的与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 第三章 结果与分析
• 3.1 转胰蛋白酶抑制剂RNAi表达载体T1代阳性植株的鉴定
• 3.2 转胰蛋白酶抑制剂RNAi表达载体T1代阳性植株的变异研究
• 第四章 结论
• 第五章 讨论
• 参考文献
• 致谢