高兴武1赵阿华2哈尔滨础润医疗器械有限责任公司哈尔滨150040
【摘要】目的：探讨分析中成药有效成分测定中毛细管电泳-电化学检测技术的应用效果。方法：应用毛细管电泳-电化学检测技术对中成药Vc银翘片进行检测，并对测定Vc银翘片中咖啡酸、绿原酸及Vc的方法进行研究，分析其测定效果。结果：毛细管电泳-电化学检测技术测定Vc、绿原酸、咖啡酸的最佳运行缓冲液条件为20mmol/L，Na4B4O7至20mmol/L，NaH2PO4（pH为8.5）；20kV为进样、分离电压效果最好；Vc、绿原酸咖啡酸回收率依次为104%、105%、94%，其相对标准偏差依次为2.3%、2.6%、3.9%。结论：毛细管电泳-电化学检测技术在测定中成药时要根据不同药物选择最佳的测定条件进行，效果较好。
【关键词】毛细管电泳；电化学检测；中成药
【中图分类号】O657.8【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）-03-209-02
毛细管电泳是测定药物成效的分离方法之一，具有进样量少、快速、高效等特点。高效毛细管电泳-电化学检测法主要是运用碳圆盘电极作为工作电极，通过对实验参数的优化测定Vc银翘片中Vc含量、绿原酸及咖啡酸成分[1]。本研究运用毛细管电泳-电化学检测法对Vc银翘片有效成分进行了测定，发现该方法操作简便，灵敏性高，可直接进行检验，安全可靠，适合用于药物的常规分析中，现详细报道如下。
1.实验方法
1.1仪器及试剂
选用自组装毛细管电泳-柱端射壁安培法电化学检测系统进行本研究测定[2]，其中含有0-30kv无级可调节性高压电源（仪器提供单位：中国科学院上海原子核研究所），75cm石英毛细管（规格：60cm×25μm，厂家：PolymicroTechnologies公司），三电极电化检测系统（碳圆盘工作电极300μm、饱和甘汞参比电极、Pt丝对电极），三维定位调节器，自动平衡记录仪（台式）（厂家：上海大华仪表厂），微电流检测器（型号：LC-3D，厂家：美国BAS公司）。
绿原酸及咖啡酸均从Sigma公司进行选购，Vc标样有华美生物工程公司位于上海的分公司进行选购，其他试剂均为国产分析纯，Vc银翘片购买于药店，本实验所用水均为二次蒸馏水。
1.2实验操作方法
1.2.1采取柱端射壁（wall-jet）电化学检测系统进行实验研究[3]，碳圆盘电极在使用前需用金相砂纸及氧化铝粉末依次进行抛光，之后借助蒸馏水进行超声清洗，时间为5min。运用时将碳圆盘电极固定在三维定位仪上，在放大镜的帮助下将电极位置进行调整，确保工作电极与毛细管位于一条直线，尽可能靠近端口，其中毛细管口应于工作电极圆心对准，在20kv下用电动进样从毛细管极端实施进样，时间为6s。使用毛细管前需使用0.1mol.L-1的NaOH进行清洁。缓冲液为20mmol/L硼砂、磷酸二氢钠混合，pH值8.5。
1.2.2标准储备液的配制：精确称取适量Vc、绿原酸、咖啡酸标样，以体积分数25%乙醇分别进行配制，容量为1×10-2mol/L的Vc、绿原酸、咖啡酸标准储备液。并使用棕色瓶将Vc、绿原酸标准储备液进行封存，放置于阴凉避光处，配制结束后需尽早使用。
2.结果
2.1电泳条件的选择
2.1.1Vc、绿原酸、咖啡酸电化学行为分析
Vc在电极电位至0.6V（vs.SCE）后响应电流出现平台；绿原酸和咖啡酸响应电流在电极电位至0.6V（vs.SCE）后快速上升，电极电位超过+0.90V（vs.SCE）时Vc、绿原酸、咖啡酸响应电流上升速度均较缓慢，但基底电流与噪音大幅上升，电极基线不稳、稳定性变差、信噪比降低。
2.1.2运行缓冲液浓度及酸度存在的影响
对缓冲液酸度与分离度及分离时间关系进行了考察，最终确定pH值为8.5，由于缓冲液的浓度也会对被测物迁移时间、分离度及峰电流造成影响。当pH=8.5时，随着缓冲液浓度的升高被测组分的分离度及迁移时间也随之增加、噪音增加、电泳峰高降低，信噪比整体降低。综合对分离度、峰电流、缓冲容量及分离时间进行考虑，发现20mmol/L，Na4B4O7至20mmol/L，NaH2PO4（pH为8.5）之间为最佳运行缓冲液选择范围。
2.1.3分离电压与进样时间的选择
对分离电压进行选择时要对迁移时间及分离效果进行综合考虑，分离电压越高则样品迁移时间越快，但是其分离效果略差于低电压时效果，而且对工作电极干扰较大。若分离电压过低，样品迁移时间旧会越长，峰形也会展宽。
2.2重现性、线性及检测下限
在上述实验条件下，将5.0×10-4mol/l的Vc、绿原酸、咖啡酸混合标准溶液进样，连续7次，其重现性良好。峰高相对标准偏差依次为4.2%、3.3%、3.7%；迁移时间RSD依次为1.6%、1.3%、2.1%；在最佳条件下对一系列不同浓度的Vc、绿原酸、咖啡酸混合标准溶液，Vc绿原酸、咖啡酸的浓度及峰电流分别为1.0×10-5-1.0×10-2mol/L、1.0×10-5-5.0×10-2mol/L，1.0×10-4-5.0×10-3mol/L，呈良好线性，以3倍噪音电流对应的浓度进行检测，三者下限依次为6×10-6mol/L、5×10-6mol/L，5×10-5mol/L。
2.3样本测定及回收率实验方法
将Vc银翘片研磨成粉，精确进行称量（0.1mg）3份每份约0.5g。分3次提取分别加入25%体积分数的乙醇10mL、5mL及3mL，均使用超声进行振荡，时间为30min，静置至温度与室温相符，通过0.22μm聚丙烯滤膜进行过滤，并将过滤液进行合并，转存至25mL容量瓶进行定容，使用缓冲液稀释后进样。在分离检测最佳条件下根据要求对Vc银翘片中Vc、绿原酸、咖啡酸含量进行测定，其中Vc回收率为104%，相对标准偏差为2.3%；绿原酸回收率为105%，相对标准偏差为2.6%；咖啡酸回收率为94%，相对标准偏差为3.9%。
3.讨论
Vc银翘片又称Vc银翘解毒片是一种较常用的中成药，主要成分为甘草、连翘、金银花，有清热解毒、辛凉解表的作用。Vc银翘片的主要有效成分为绿原酸（caffeicacid）及咖啡酸（chlorogenicacid）。绿原酸的药理作用为利胆、抗菌、止血等，咖啡酸则为绿原酸的水解产物，两者分子结构十分相似，常于同一种药材或中药中出现，在进行药物含量测定分析时很难将其分离，因此找到有效对绿原酸及咖啡酸药物分离测定的方法十分重要。
有相关文献中对其进行测定的方法有多种[4]，主要为高效液相色谱法、光光度法等，但是这些检测方法整体操作繁杂或存在检测林敏度不高的缺点，未见同时可对绿原酸及咖啡酸、Vc含量检测的相关报道。本研究发现工作电极电位会对毛细管电泳-电化学检测技术检测下限及灵敏度造成直接影响。综合考虑各因素发现最佳检测电极电位是+0.90V（vs.SCE），此状态下检测下限及本底电流较低，稳定性相对较好。发现缓冲液的酸度将对毛细管内壁电渗流（EOF）、ζ电位及被测组分荷电情况造成直接影响，然后对被测物分离及迁移时间进行影响，对酸度对电泳造成的影响进行研究是优化测定条件的重要因素。本研究以20kV为进样、分离电压，在对分离度进行保证的前提下可以在短时间内取得最好的分离效果。
综上所述，毛细管电泳-电化学检测技术测定Vc、绿原酸、咖啡酸的最佳条件为20mmol/L，Na4B4O7至20mmol/L，NaH2PO4（pH为8.5）之间为运行缓冲液最佳选择范围，分离电压取20kV，在上述条件下进行可快速对三种物质进行分离，整体效果较好。
参考文献：
[1]彭友元，楚清脆，叶建农等.毛细管电泳-电化学检测Vc银翘片中的有效成分[J].华东师范大学学报（自然科学版），2003，（3）：98-101.
[2]周晓光.毛细管电泳电化学法在中药鉴别研究中的应用[D].中国科学院长春应用化学研究所，2007.
[3]丁飞，陈黎明.毛细管电泳-安培检测法同时测定中成药珍菊降压片中有效成分[J].理化检验-化学分册，2008，44（5）：430-432.
[4]许靖，王成芳，杜树山等.金钱白花蛇商品药材的高效毛细管电泳指纹图谱研究[J].中成药，2014，36（3）：563-566.