单加氧酶转基因在棉花基因组中表达稳定性和转基因雄性不育性研究

论文摘要

陆地棉（Gossypium hirsutum L.）是我国重要的经济作物之一,也是我国引种最为成功的外来物种。由于其种质资源匮乏,采用常规育种方法,很难培育出在农艺性状和经济性状方面有突破性的新品种。采用转基因技术,将对植物的生理、生化代谢过程有促进或干扰作用的有关基因导入栽培的陆地棉基因组中,是培育棉花新品种和创造出棉花新的转基因雄性不育类型的一条有效途径。本实验室已经通过农杆菌介导的转基因法将来源于拟南芥的与生长素合成有关的单加氧酶（Mono）基因的三种转化结构成功导入到棉花基因组中并从其转基因系群体中分离到了雄性不育植株。本研究将对目的基因mono基因和标记基因NPTⅡ在T5代转基因系基因组中转基因在转录水平上的表达进行研究,鉴定其在转基因棉花基因组中的遗传稳定性,并对转mono基因诱发的棉花转基因雄性不育性进行了形态学和细胞学研究。本研究取得的主要实验结果如下:1、改良了常规的酸性酚-异硫氰酸胍-氯仿法,能够在2-3小时内快速地提取棉花嫩叶RNA。此外,还能提取棉花的各种花器官,包括花药、花冠、胚珠、花粉和纤维等的RNA。2、对25个转基因植株以标记基因NPTⅡ为探针进行RNA斑点杂交鉴定,阳性率为92%;对32个转基因植株以目的基因mono为探针进行RNA斑点杂交鉴定,阳性率为90.6%。显示了标记基因NPTⅡ和目的基因mono基因在高世代棉花转基因系在转录水平上的表达稳定性。通过Northern杂交进一步显示了标记基因NPTⅡ和目的基因mono基因在高世代棉花转基因系基因组中能够稳定转录,同样表明其具有很高的遗传稳定性。3、对转基因不育株的形态特征进行观察结果表明,与转化受体品系4105比较,其形态特征明显改变,植株矮小且紧凑;花器小,开花后,花丝短小、稀疏而凌乱,柱头较长,花药小且少,部分花药不开裂散粉,无花粉粒。4、转基因不育株花粉粒经醋酸洋红染色显示无生活力,不育花粉粒皱瘪、无内含物、花粉粒小,不能被醋酸洋红染色,而可育对照花粉粒大、内含物充实、被染成红色。5、对半不育株、不育株的连续观察结果显示,53株半不育株都发生了较明显的育性逆转现象,17株不育株中有14株发生了较明显的育性逆转现象,另3株稳定。育性逆转都是由不育转为可育,大部分集中发生在8月3号到8月9号之间所开的花。根据华中农业大学农业气象室的气象资料显示,2007年7月5日平均温度为31.9℃,最高气温35.7℃,最低气温28.5℃,即在开花前28天,且开花前28天的前后3天,即7月3日至7月8日的平均温度为31.87℃。可能较高温度影响了花粉母细胞的减数分裂,使不育株的育性恢复。6、转基因棉花雄性不育性主要表现在花粉母细胞减数分裂过程不正常,包括花粉母细胞不分裂退化、二分体阶段退化、四分体阶段退化、三分体、多分体、无丝分裂、花粉母细胞不对称分裂、不同步分裂、落后染色体、畸形四分体、和大量微核等异常现象。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 单加氧酶基因研究
• 1.2 棉花总 RNA提取的研究
• 1.2.1 棉花中酚类化合物的干扰及对策
• 1.2.2 棉花中多糖的干扰及对策
• 1.2.3 棉花中蛋白杂质的影响及对策
• 1.2.4 棉花中次级代谢产物的影响及对策
• 1.3 转基因的遗传稳定性和外源基因的表达研究
• 1.3.1 外源基因的整合特性
• 1.3.2 转化外源基因的稳定性
• 1.4 与花粉发育相关的基因
• 1.4.1 与花粉发育起始相关的基因
• 1.4.2 与减数分裂相关的基因
• 1.4.3 与花粉有丝分裂相关的基因
• 1.4.4 生殖细胞有丝分裂相关基因
• 1.5 植物雄性不育的应用价值与基因工程创建雄性不育
• 1.5.1 植物雄性不育的应用价值
• 1.5.2 基因工程创建雄性不育
• 1.6 棉花雄性不育的细胞学基础
• 第二章 Mono基因在转基因棉花中的表达稳定性研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 棉花材料
• 2.1.2 根癌农杆菌和转化载体
• 2.1.3 部分试剂来源
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 棉花总 RNA的快速提取与检测
• 2.2.2 纯化 RNA的Northern斑点杂交
• 2.2.3 Northern杂交
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 硫氰酸胍法提取棉花总 RNA的改良
• 2.3.2 纯化 RNA的Northern斑点杂交
• 2.3.3 纯化 RNA的Northern杂交
• 2.4 讨论
• 2.4.1 异硫氰酸胍法提取棉花总 RNA的改良
• 2.4.2 Northern斑点杂交与外源基因表达
• 2.4.3 Northern杂交与转基因棉花的稳定表达
• 2.4.4 mono基因与组织特异性表达
• 第三章 转基因棉花雄性不育性及花粉败育的细胞学研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 不育系的形态学特征
• 3.2.2 花粉育性鉴定及其与散粉程度的关系
• 3.3 讨论
• 3.3.1 雄性不育系植株性状与花器形态
• 3.3.2 雄性不育系育性与环境的关系
• 3.3.3 雄性不育系的败育时期
• 3.3.4 mono基因对转基因棉花生育特性的影响
• 3.3.5 mono基因与无丝分裂
• 附录
• 参考文献
• 致谢