Fengycin对Rhizopus stolonifer作用机理研究

论文摘要

芽孢杆菌能产生多种抗菌物质,其中大部分是多肽,主要抑制革兰氏阳性茵；有些多肽还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母菌。由于Bacillus subtilis抗菌物质抑菌谱广、抗茵效果强,因此在农业、医学和轻工等领域具有重要应用价值。本实验室分离到一株可产生抗微生物脂肽fengycin的枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis fmbJ,前期研究表明该fengycin对丝状真菌Rhizopus stolonifer具有显著的抑菌活性。Rhizopus stolonifer是果蔬采收后的主要病原菌,在桃果贮藏、运输和销售中,常常引起果实腐烂损失。控制果蔬采后病害的传统的手段是使用化学杀菌剂,由于化学杀菌剂在果蔬中的残留毒性对人类健康有潜在危险,因此,利用微生物抗菌肽进行生物防治方面具有广阔的应用前景。目前,大量关于抗真菌机制的研究主要集中在两方面：（1）攻膜作用,在脂膜上形成孔洞,使重要的内容物外泄；（2）阻止、破坏真菌细胞壁的合成。为了更全面、深入的了解抗真菌肽的作用机制,本文主要从fengycin对Rhizopus stolonifer的呼吸链、营养物质利用及细胞凋亡三方面展开研究,得到以下研究结果：1.阐述了fengycin对Rhizopus stolonifer呼吸代谢和线粒体电子传递链的影响。通过对Rhizopus stolonifer呼吸速率测定发现,fengycin主要抑制Rhizopus stolonifer呼吸代谢的HMP途径；对Rhizopus stolonifer线粒体电子传递链上关键酶的活性进行研究,结果显示,随着fengycin浓度的增大,体内和体外作用都使琥珀酸脱氢酶活性呈现先降后升的现象。随着fengycin浓度的升高,体外作用时,NADH脱氢酶活性变化不大；体内作用时,NADH脱氢酶活性呈下降趋势。说明fengycin不能与NADH脱氢酶相结合而抑制其活性,而是抑制Rhizopus stolonifer电子传递链上NADH脱氢酶相关基因的表达,降低其活性。因此,fengycin能使Rhizopus stolonifer电子传递受阻,导致其能量合成受到抑制,影响生长。2.确定了fengycin对Rhizopus stolonifer营养物质利用的影响,结果发现fengycin使Rhizopus stolonifer对营养物质的利用减少；SDS-PAGE电泳结果表明,fengycin处理后,使Rhizopus stolonifer的蛋白质合成异常；对Rhizopus stolonifer菌体中糖和蛋白质含量测定,结果显示随着fengycin浓度的升高,Rhizopus stolonifer体内还原糖含量呈下降趋势,总糖和蛋白质含量呈上升趋势。并且,与空白对照相比,总糖和蛋白质含量均显著升高。表明Rhizopus stolonifer体内物质的分解代谢受到抑制。3.阐明了fengycin能够诱导Rhizopus stolonifer细胞发生凋亡作用。通过电镜对Rhizopus stolonifer的超微结构观察发现：fengycin使Rhizopus stolonifer核染色质浓缩聚集,菌丝体起泡变圆,活性氧（ROS）积累,线粒体膜电位下降,细胞膜磷脂酰丝氨酸呈现外翻现象,基因组DNA片段化,说明Rhizopus stolonifer出现细胞凋亡。此外Annexin V染色和TUNEL检测实验结果表明：fengycin浓度较低时（<50μg/ml）,使Rhizopus stolonifer细胞发生凋亡;fengycin浓度较高时（>50μg/ml）,使Rhizopus stolonifer细胞死亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 抗菌肽的特点
• 2 抗菌肽的作用机制
• 2.1 抑制细胞壁的形成
• 2.2 对细胞膜的作用
• 2.3 抑制细胞呼吸
• 2.4 抑制胞外或胞内膜蛋白的形成
• 2.5 破坏细胞DNA
• 2.6 诱导细胞凋亡
• 3 抗菌肽的应用前景
• 3.1 在农业上应用
• 3.2 在畜牧业上的应用
• 3.3 在医药上的应用
• 3.4 在食品上的应用
• 4 本研究的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 Fengycin对Rhizopus stolonifer呼吸代谢的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Fengycin对Rhizopus stolonifer呼吸代谢的影响
• 2.2 Fengycin对Rhizopus stolonifer NADH脱氢酶活性的影响
• 2.3 Fengycin对Rhizopus stolonifer琥珀酸脱氢酶活性的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 Fengycin对Rhizopus stolonifer营养物质利用的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Fengycin对Rhizopus stolonifer营养物质利用的影响
• 2.2 Fengycin对Rhizopus stolonifer糖含量的影响
• 2.3 Fengycin对Rhizopus stolonifer蛋白质含量的影响
• 2.4 Fengycin对Rhizopus stolonifer蛋白质合成的影响
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 Fengycin对Rhizopus stolonifer细胞凋亡的影响
• 1 材料方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 Hoechst 33258染色
• 2.2 Fengycin对Rhizopus stolonifer ROS积累的影响
• 2.3 Fengycin对Rhizopus stolonifer线粒体膜电位的影响
• 2.4 Fengycin对Rhizopus stolonifer PS外翻的影响
• 2.5 TUNEL检测
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 全文结论
• 创新点
• 研究生期间发表的研究论文
• 致谢