RGD-重组蛛丝蛋白和柞蚕丝素蛋白作为组织工程支架材料的研究

论文摘要

蜘蛛丝蛋白纤维具有较高的强度、弹性、柔韧性、伸长度以及良好的生物降解性,在组织工程支架材料领域引起了极大的研究兴趣。RGD（Arg-Gly-Asp）三肽序列是细胞表面整合素的特异配体,能够促进细胞的黏附。本室建立了利用基因工程和高密度发酵技术生产RGD-重组蜘蛛蛋白以及重组蛋白规模纯化的工艺,为其后续研究奠定了基础。柞蚕丝是以野柞蚕茧为原料缫制而成的天然蚕丝纤维,是我国的宝贵资源,但目前主要用作普通的纺织原料。柞蚕丝可以编织成形状类似肌腱的编织带,同时,其优异的力学性能使其能够承受机体的拉伸应力。此外,柞蚕丝中还含有天然存在的RGD序列。因此,柞蚕丝纤维作为一种潜在的组织工程肌腱支架材料,有着广泛的应用前景。本研究制备了两种RGD蛋白（重组蛛丝蛋白pNSR-16和柞蚕丝素蛋白）的多孔复合支架材料,并首次利用静电纺丝技术制备了pNSR-16纳米复合支架材料;通过傅立叶转换红外光谱（FTIR）和力学性能的测定,对制膜过程中两种蛋白分子构象或复合材料力学性能的影响因素进行了探讨,结果表明:甲酸能促进pNSR-16分子构象向无规卷曲转变,溴化锂、醇类、高分子材料（聚乙烯醇和壳聚糖）可以诱导pNSR-16分子构象向β-折叠转化;小分子增塑剂、高分子量PVA能够促进柞蚕丝素蛋白分子构象向β-折叠转变,提高加热温度、交联、增塑剂PEG则破坏了其β-折叠构象,高分子量PVA、甘油增塑、化学交联、75%乙醇变性均能提高柞蚕丝素蛋白复合材料的力学性能。通过浸提液毒性实验和细胞与支架的体外联合培养,考察了两种蛋白支架材料的细胞相容性。根据细胞毒性实验ISO10993制定的评价标准得出,两种支架材料的浸提液毒性为1级,反应合格。扫描电镜观察结果表明两种支架均能促进NIH3T3细胞的黏附和生长,具有良好的细胞相容性。分别利用肌腱细胞和兔跟腱损伤模型,从体外和体内两个水平对柞蚕丝纤维作为组织工程肌腱支架材料的可行性进行了研究。细胞与支架的体外联合培养结果表明:柞蚕丝纤维能够支持肌腱细胞的黏附和生长。体内实验通过大体观察、组织学染色、免疫组化、扫描电镜观察以及生物力学测定等结果表明,柞蚕丝能够支持兔跟腱的修复,初步认为其作为组织工程肌腱支架材料具有一定的可行性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 组织工程支架材料
• 1.1.1 支架材料的作用及理想支架材料的要求
• 1.1.2 组织工程支架材料的发展趋势
• 1.1.3 目前应用的支架材料
• 1.1.4 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）三肽序列在组织工程支架中的应用
• 1.2 蛛丝蛋白
• 1.2.1 蜘蛛丝的结构组成与理化性质
• 1.2.2 天然蜘蛛丝的力学性能
• 1.2.3 天然蛛丝生物相容性
• 1.2.4 再生丝或重组丝的研究
• 1.3 柞蚕丝素蛋白
• 1.3.1 柞蚕丝素蛋白的结构组成与理化性质
• 1.3.2 再生柞蚕丝素蛋白的研究现状
• 1.4 支架材料的制备及表征方法
• 1.4.1 多孔膜支架的制备
• 1.4.2 纳米纤维支架的制备
• 1.4.3 支架材料的性能表征
• 1.5 组织工程肌腱的研究
• 1.5.1 组织工程肌腱支架材料的研究现状
• 1.5.2 肌腱组织工程的研究方法
• 1.5.3 肌腱组织工程目前存在的问题
• 1.6 本研究的背景、内容及意义
• 1.6.1 本研究的背景及意义
• 1.6.2 本研究的主要内容
• 第2章 RGD-重组蛛丝蛋白pNSR-16作为组织工程支架材料的研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 培养基等常用溶液的配方
• 2.2 方法
• 2.2.1 pNSR-16/BL21（DE3）plysS的高密度发酵
• 2.2.2 表达产物pNSR-16的分离纯化
• 2.2.3 pNSR-16/PVA多孔复合支架材料的制备
• 2.2.4 FTIR研究制膜过程中pNSR-16分子构象的影响因素
• 2.2.5 pNSR-16/PVA纳米复合支架材料的制备
• 2.2.6 pNSR-16/PVA支架材料的形态结构表征
• 2.2.7 pNSR-16/PVA多孔支架材料的细胞相容性
• 2.3 结果
• 2.3.1 pNSR-16/BL21（DE3）plysS的高密度发酵
• 2.3.2 pNSR-16的纯化
• 2.3.3 制膜过程中pNSR-16分子构象的影响因素
• 2.3.4 pNSR-16/PVA多孔支架材料及纳米支架材料的形态
• 2.3.5 pNSR-16/PVA多孔支架材料的细胞相容性
• 2.4 讨论
• 第3章 柞蚕丝素蛋白作为组织工程支架材料的研究
• 3.1 材料
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 柞蚕丝素蛋白溶剂的选择
• 3.2.2 WSF/PVA复合材料的制备
• 3.2.3 材料结构与性能表征
• 3.2.4 WSF/PVA-124复合材料的细胞相容性研究
• 3.3 结果
• 3.3.1 柞蚕丝素蛋白的溶剂
• 3.3.2 复合材料的形态结构
• 3.3.3 红外光谱（IR）分析不同制膜条件对柞蚕丝素蛋白构象的影响
• 3.3.4 不同制膜条件对复合材料力学性能的影响
• 3.3.5 WSF/PVA-124复合材料的细胞相容性
• 3.4 讨论
• 第4章 柞蚕丝纤维作为组织工程肌腱支架的研究
• 4.1 材料
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 实验器材
• 4.2 方法
• 4.2.1 人工腱的制备
• 4.2.2 柞蚕丝纤维的肌腱细胞相容性
• 4.2.3 柞蚕丝纤维作为人工腱修复兔跟腱损伤
• 4.3 结果
• 4.3.1 柞蚕丝纤维的肌腱细胞相容性
• 4.3.2 柞蚕丝纤维作为人工腱修复兔跟腱损伤
• 4.4 讨论
• 结论
• 附录 英文缩略词表
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历