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抗人类疱疹病毒6型南京株E5单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

2020-12-04阅读(205)

抗人类疱疹病毒6型南京株E5单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

论文摘要

人类疱疹病毒6型（Human herpesvirus 6,HHV-6）是一类嗜人类淋巴细胞的双链DNA病毒,于1986年由美国癌症中心的Salahuddin等首先从淋巴增生及AIDS患者外周血单个核细胞中分离到,与人类疱疹病毒7型（HHV-7）及人巨细胞病毒（CMV）同属于疱疹病毒β亚科。目前认为HHV-6是婴幼儿急疹（ES）的病因,另外还与神经胶质瘤、脑膜脑炎、AIDS、慢性疲劳综合症、器官移植后感染、多发性硬化症等多种疾病有关,但其致病机理目前尚未清楚。HHV-6基因组为一线性双链DNA分子,大小约160～170Kbp,结构上可分为3个部分,即序列独特区（UL区）,左右末端各有一个正向重复序列（DRL和DRR区）,且有119个开放读码框（ORF）。根据其基因结构差异和抗原性可分为HHV-6A、B两种亚型,GS、U1102是HHV-6A亚型代表株,而Z29是B亚型代表株,且序列的同源性在96%以上,HHV-6广泛存在于健康成人及儿童外周血淋巴细胞和唾液中,其原发感染一般发生在6个月～2岁的婴幼儿,高峰期在6～9个月,其后在体内建立持续性感染,并长期呈潜伏感染。我室于1994年在国内首次分离鉴定出HHV-6南京地方株8株,并详细研究了南京株E5（CN5）的病毒学、免疫学、生物学特性及病毒形态学超微结构,为本次研究奠定了良好的基础。本研究采用蔗糖密度梯度离心法纯化的南京株HHV-6 E5病毒抗原免疫8周龄、雌性BALB/c小鼠,采用常规方法融合,间接ELISA方法筛选,并经3次有限稀释法亚克隆后,获得3株能持续稳定分泌特异性抗HHV-6抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为JA9、JYE7、JYE8。将获得的3株杂交瘤细胞株传代扩增,注射到用Pristane预刺激的BALB/c小鼠体内制备腹水,并进行初步纯化。单抗Ig亚类鉴定表明:JA9为IgG1,κ亚型、JYE7和JYE8为IgM,λ亚型;腹水效价分别为1:0.8X105、1:0.256X105、1:0.128 X105;杂交瘤细胞染色体计数显示3株细胞染色体数均约95条以上;间接免疫荧光实验显示:3株单抗均能与HHV-6 E5感染的CBMCs呈阳性反应,而与未感染CBMCs呈阴性反应;其中JA9单抗Western-blot实验结果进一步表明其可与HHV-6 E5约75ku大小的病毒蛋白结合。本研究收集口腔肿瘤（口腔鳞癌及其癌前病变）、脑肿瘤（神经胶质瘤及脑膜瘤）、婴幼儿急疹、免疫抑制剂使用者（肾移植及肾病综合症）及健康人群唾液标本分别为41份、40份、36份、37份、40份,共194份。采用巢式PCR及ELISA法检测唾液标本中HHV-6的阳性率,结果患者的HHV-6阳性检出率均高于健康人群且有统计学意义。本研究在自分离鉴定的HHV-6南京株E5的基础上,成功制备并初步鉴定出3株抗人类疱疹病毒6型南京株E5的单克隆抗体,将为HHV-6的进一步研究奠定基础,并为临床诊断提供了可能。

论文目录

  • 目录
  • 英文缩写词
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 引言
  • 第一部分:人类疱疹病毒6型的培养、鉴定及纯化
  • 1.材料和方法
  • 2.抗原的纯化
  • 3.结果
  • 4.讨论
  • 参考文献
  • 第二部分:抗人类疱疹病毒6型单克隆抗体的制备与鉴定
  • 1.材料
  • 2.方法
  • 3.结果
  • 4.讨论
  • 参考文献
  • 第三部分:抗HHV-6单克隆抗体在临床中的初步应用
  • 1.材料和方法
  • 2.结果
  • 3.讨论
  • 参考文献
  • 全文结论
  • 致谢
  • 硕士期间发表的论文
  • 综述
  • 附录 测序图

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