论文摘要
研究目的:iASPP是p53凋亡促进蛋白（apoptosis stimulating protein of p53,ASPP）家族的抑制性成员（inhibitory member of ASPP of p53 family,iASPP）,是新发现的一个p53拮抗基因,它存在于从线虫到人类等多种生物细胞内,高度保守。作为一个p53重要的癌症抑制因子,iASPP参与多种肿瘤的发生。我们实验室通过半定量RT-PCR方法检测了iASPP在急性白血病（acute leukemia,AL）细胞中的表达情况,发现AL患者iASPP表达显著高于正常组及AL完全缓解组,这一结果提示iASPP基因过表达可能与AL的发生发展有关。本研究通过RNA干扰下调iASPP癌基因在白血病细胞系中的表达,探索iASPP在AL发生中的作用机制,以及p53在iASPP调节通路中的作用。研究方法:应用RNA干扰的方法抑制癌基因iASPP在p53野生型白血病细胞系Nalm6和p53突变型白血病细胞系K562中的表达,RT-PCR测定iASPP mRNA水平,Westernblot检测iASPP蛋白水平。观察细胞形态和结构改变,流式细胞术分析细胞周期和分化抗原的表达,集落形成实验分析细胞增殖能力的改变,Annexin V标记,流式细胞术分析细胞凋亡。研究结果:1)iASPP特异性的小分子双链RNA（siRNA）处理白血病细胞后,iASPP mRNA及蛋白水平均下调。2)与对照组相比,iASPP siRNA处理组的细胞集落形成能力明显下降,K562细胞集落数由908±20.95/孔降至663.3±10.6/孔,下降26.95%（P＜0.05）,Nalm6细胞的集落数变化更为明显,由484.7±14.6/孔降至158±7/孔（P＜0.05）,下降了67.4%。3)iASPP表达下调增强了p53野生型白血病细胞系Nalm6对化疗药物依托泊甙（VP16）和柔红霉素（DNR）的敏感性。与iASPP siRNA和VP16单独处理组相比,联合使用iASPP siRNA和VP16时,凋亡细胞比例明显升高,细胞早期凋亡率分别由（9.43±3.86）%和（34.11±9.9）%升高到（52.29±6.79）%（P＜0.01,P＜0.05）;同样,与iASPP siRNA和DNR单独处理组相比,联合使用iASPP siRNA和DNR时,凋亡细胞比例也明显升高,细胞早期凋亡率分别由（8.4±3.0）%和（23.7±2.7）%升高到（45.1±4.5）%（P＜0.01,P＜0.01）。而在p53突变型白血病细胞系K562中,iASPPsiRNA不能显著增强白血病细胞对VP16和DNR的敏感性（P＞0.05）,提示p53表达在iASPP介导的细胞凋亡中发挥作用。4)RT-PCR结果显示,化疗药物VP16和DNR作用于Nalm6和K562细胞后,并不影响iASPP在细胞中的表达（P＞0.05）。5)Nalm6及K562细胞中凋亡相关基因c-Myc、bcl-2的mRNA表达水平随着iASPP的下调而下调。c-Myc分别降至对照组的（23.2±6.8）%和（28.2±7.3）%（P＜0.01,P＜0.01）.Bcl-2分别降至对照组的（65.9±5.4）%和（89.7±2.1）%（P＜0.05,P＜0.05）。结论:1)iASPP参与调控白血病细胞的凋亡、增殖活性,其表达异常可能是白血病发生的一个重要原因。2)下调iASPP的表达能够增强p53野生型白血病细胞对化疗药物的敏感性,iASPP有望成为白血病治疗的新靶点。第二部分DJ-1基因在急性白血病中的表达及其对白血病细胞增殖、凋亡活性影响的研究研究目的:初步探讨AL患者细胞和白血病细胞系中癌基因DJ-1的表达及其临床意义。在确定白血病细胞DJ-1表达升高后,下调白血病细胞系中DJ-1的表达,进一步确定DJ-1在急性白血病发生中的作用机制。研究方法:我们采用半定量RT-PCR检测了74例初发急性白血病（AL）、10例MDS和9个白血病细胞系DJ-1基因mRNA的表达。应用RNA干扰的方法抑制癌基因DJ-1在白血病细胞系K562和HL60中的表达,应用真核表达载体在白血病细胞系K562外源性过表达DJ-1。RT-PCR测定DJ-1 mRNA水平,Western blot检测蛋白水平。观察细胞形态和结构改变,流式细胞术分析细胞周期和分化抗原的表达,集落形成实验分析细胞增殖能力的改变,Annexin V标记,流式细胞术分析细胞凋亡。RT-PCR测定DJ-1对细胞周期、凋亡相关基因及肿瘤抑制因子PTEN表达水平的影响。研究结果:1)高表达的DJ-1在AL的发生中可能起一定作用。DJ-1在AL患者细胞和白血病细胞系中的表达水平显著高于正常对照细胞（P＜0.01）。急性髓系白血病（Acutemyeloid leukemia,AML）和急性淋巴细胞白血病（Acute lymphocytic leukemia,ALL）之间差异无显著性（P＞0.05）。另外,DJ-1基因在AL细胞中的表达与性别、年龄、最初白细胞计数、原始细胞百分比及CD34表达无关（P＞0.05）。2)DJ-1特异性的siRNA处理白血病细胞后,DJ-1 mRNA水平下调（P＜0.01）。3)与对照组细胞相比,DJ-1 siRNA处理组细胞的生长增殖能力减弱。DJ-1表达下调后,细胞的倍增时间延长,集落形成能力明显下降。K562和HL60细胞的倍增时间分别由（33.4±0.5）小时和（24.0±0.4）小时延长至（44.4±1.8）小时和（29.1±0.9）小时（P＜0.05,P＜0.05）。K562细胞DJ-1 siRNA处理组形成的集落数下降了（45.0±2.5）%（P＜0.01）;HL60细胞DJ-1 siRNA处理组形成的集落数下降了（39.5±5.0）%（P＜0.01）。4)DJ-1表达下调对白血病细胞的分化没有影响（P＞0.05）。5)DJ-1表达下调增强了白血病细胞对化疗药物VP16的敏感性,联合使用VP16和DJ-1 siRNA时,凋亡细胞比例明显升高,与DJ-1 siRNA单独处理组和单纯加药组向比,K562细胞早期凋亡率分别由（3.7±0.5）%和（17.3±0.6）%升高到（35.71±1.7）%（P＜0.05,P＜0.01）。HL60细胞早期凋亡率分别由（1.3±0.3）%和（24.6±0.9）升高到（33.8±1.6）%（P＜0.05,P＜0.01）。6) RT-PCR结果显示,DJ-1能够调节周期和凋亡相关基因Cdk2、Cyclin D1、c-Myc、NF-kB和bcl-2 mRNA在K562和HL60细胞中的表达,它们的表达水平随着DJ-1的抑制分别降至了对照组的（80.2±4.5）%、（48.2±4.2）%、（72.1±5.6）%、（61.1±4.7）%和（38.9±5.7）%（P＜0.05）。7)DJ-1负向调控肿瘤抑制因子PTEN表达,DJ-1表达下调后,K562和HL60细胞的PTEN mRNA表达水平分别增加了（78.3±6.3）%（P＜0.01）和（27.3±8.7）%（P＜0.05）。8)外源性过表达DJ-1,能够促进细胞的生长增殖。与对照克隆相比,三株高表达外源性DJ-1的阳性克隆细胞集落形成能力显著增强,形成的集落数分别为刘照克隆集落数的（2.19±0.46）倍、（2.55±0.54）倍和（2.52±0.35）倍（P＜0.05）。9)外源性过表达DJ-1,能降低细胞PTEN基因的表达水平,但不能改变PTEN启动子的甲基化状态（P＜0.05）。结论:1)DJ-1的表达水平在初治AL患者细胞和白血病细胞系中显著高于正常人,提示白血病细胞中的DJ-1表达水平上调,DJ-1功能增强可能是白血病的发生发展的一个重要原因。2)DJ-1过表达可能是通过异常调控白血病细胞的增殖、凋亡来促进白血病发生的,DJ-1有望成为白血病治疗的新靶点。3)Cdk2、Cyclin D1、c-Myc、NF-kB和bcl-2等基因参与了DJ-1介导的白血蚕赴鲋秤氲蛲觥?4) PTEN介导的PI3K/Akt信号传导通路障碍可能是DJ-1过表达引发肿瘤的个重要机制。