具杀线虫活性植物内生细菌和根际放线菌的筛选及防效研究

论文摘要

植物寄生线虫是危害植物的重要病原物,为了筛选到对植物寄生线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌和植物根际放线菌。本研究进行了内生细菌杀线虫活性菌株的分离、筛选和鉴定,并对其中活性最强的菌株进行了发酵条件的优化；研究了内生细菌和根际放线菌发酵产物杀线虫物质的稳定性；还研究了内生细菌和放线菌对根结线虫的防治效果,以及内生细菌和放线菌复配对根结线虫的防治效果；结果如下：1、采用组织分离法从6种植物中分离筛选出112株内生细菌,用黄瓜无菌苗定殖量测定法筛选得到64株能稳定定殖的菌株。以松材线虫为靶标,用直接触杀法进行筛选,从这64株能稳定定殖的菌株中筛选得到13株对松材线虫具有较高杀线虫活性的植物内生细菌,这些菌株的发酵上清液对松材线虫处理24h杀线虫率均达到了100%；其中BCM2、SZ5、CCM7和DP1这4个菌株的杀线虫活性较高,发酵上清液稀释3倍处理24h杀线虫率均达到95%以上,DP1和SZ5菌株达到了100%；并发现部分菌株发酵液能使线虫虫体发生渗漏或消解。2、同时本文还对土壤中分离得到的326株放线菌进行了杀线虫活性的筛选,得到了21株具有杀线虫活性的放线菌,这21株放线菌的发酵上清液对松材线虫的24h处理死亡率均达到了80%以上,其中有8株放线菌发酵液的杀线虫活性达到了100%,而且部分菌株也能产生使线虫消解的物质。经过对其中16株活性较高的放线菌进行复筛,得到了五株活性较好的放线菌,分别为：NK17、NK19、NK27、NK29和V21。3、采用生理生化鉴定和16SrDNA序列测定方法鉴定了4株高活性植物内生细菌的归属种类,结果鉴定DP1和CCM7为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）, BCM2和SZ5是蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）。4、经过杀线虫代谢物质的理化性质的研究和发酵液中杀线虫活性物质的稳定性测定,证明5株放线菌产生的杀线虫物质均是一种可以挥发的小分子碱性物质；4株植物内生细菌产生的物质是一种对蛋白酶稳定、耐热不耐酸碱且长时间保藏活性不下降的小分子肽类物质。5、采用单因素法测定4株植物内生细菌发酵产生杀线虫物质的最佳碳氮源,并对这4株高活性植物内生细菌菌株采用正交实验法优化发酵条件,结果表明这4株植物内生细菌产生杀线虫物质的最佳碳源是蛋白胨,最佳氮源是牛肉膏,正交优化后使发酵液杀线虫效果提高了4倍。6、用盆栽苗灌根法研究了活性放线菌和植物内生细菌对根结线虫的防治效果以及放线菌和内生细菌的复合防效。放线菌对番茄根结线虫的防效结果较好的是NK29和NK17,分别为38.17%和37.63%；而供试的7株植物内生细菌中除DP1外的6株植物内生细菌对番茄根结线虫均有一定的防治效果,其中BCM2和DP24对番茄根结线虫的防治效果较好,分别为57.35%和50%,其次为CCM7和DLJ1。将BCM2和CCM7分别进行对番茄根结线虫的治疗实验和防治实验,结果表明这两株内生细菌对番茄根结线虫病的治疗结果并不理想,但是对于防治根结线虫却有一定的效果。放线菌和内生细菌复配防效结果表明：在不影响植株长势的情况下,对根结线虫有抑制作用的菌株复配方式为BCM2+NK17和CCM7+NK29,这两种复配方式下植株的长势均与阿维菌素处理组相当,且优于清水对照处理组,对根结线虫的防效分别为57.81%和37.89%。本研究从菌种筛选到产物性质鉴定再到防效的测定,一系列结果均证明土壤中和经济作物体内均存在一定数量的能产生杀线虫活性物质的放线菌和植物内生细菌,其中一些细菌产生的杀线虫物质具有较强的稳定性。认为杀线虫活性的植物内生细菌具有很大的生防潜力。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 综述
• 1、植物寄生性线虫病的研究概况
• 1.1 植物寄生性线虫的生物学特性
• 1.1.1 植物寄生线虫的形态
• 1.1.2 侵染特性
• 1.1.3 植物寄生线虫的传播
• 1.1.4 植物寄生性线虫的生活史
• 1.2 植物寄生性线虫的危害
• 1.2.1 根结线虫和胞囊线虫的危害
• 1.2.2 松材线虫的危害
• 1.3 植物寄生性线虫的防治途径
• 1.3.1 化学防治
• 1.3.2 农业措施防治
• 1.3.3 生物防治
• 2 细菌对植物寄生线虫的生物防治研究进展
• 2.1 植物寄生线虫生防细菌的种类
• 2.1.1 根际细菌
• 2.1.2 内生细菌
• 2.1.3 线虫专性寄生细菌
• 2.2 生防细菌对植物寄生线虫的作用机理
• 2.2.1 产生杀线虫物质
• 2.2.2 改变根系分泌物
• 2.2.3 营养空间位点的竞争
• 2.2.4 诱导植物系统抗性
• 3 杀线虫放线菌的研究进展
• 3.1 杀线虫放线菌的来源
• 3.1.1 陆生放线菌
• 3.1.2 海洋放线菌
• 3.2 杀线虫放线菌的作用机理
• 4 实验设计
• 第二章 具杀线虫作用植物内生细菌和根际放线菌的筛选
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验仪器和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 测试线虫及其培养和分离方法
• 1.2.2 放线菌的分离、纯化和保存
• 1.2.3 具杀线虫活性放线菌的筛选
• 1.2.4 植物内生细菌的分离和定殖测定
• 1.2.5 具杀线虫活性植物内生细菌的筛选
• 1.2.6 具杀线虫活性放线菌和植物内生细菌的复筛
• 1.2.7 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 具杀线虫活性放线菌的初步筛选结果
• 2.2 具杀线虫活性的植物内生细菌的筛选结果
• 2.3 高活性放线菌的复筛
• 2.4 高活性植物内生细菌的复筛结果
• 3 小结与讨论
• 第三章 具杀线虫活性植物内生细菌的鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 引物合成
• 1.1.3 实验仪器和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株的培养、形态特征和生理生化特征
• 1.2.2 菌株16SrDNA的扩增和序列分析
• 1.2.2.1 菌株16SrDNA的PCR扩增
• 1.2.2.2 扩增后PCR产物的割胶回收纯化
• 1.2.2.3 测序
• 1.2.3 系统发育与分析
• 2 结果与分析
• 2.1 具杀线虫活性内生细菌的培养、形态特征和生理生化特征
• 2.1.1 菌株培养、形态特征
• 2.1.2 菌株生理生化特征
• 2.2 具杀线虫活性内生细菌16SrDNA序列的PCR扩增结果
• 2.3 具杀线虫活性内生细菌16SrDNA序列
• 2.4 具杀线虫活性内生细菌16SrDNA序列相似性比较与系统发育树
• 3 小结与讨论
• 第四章 根际放线菌和植物内生细菌的杀线虫产物性质研究
• 第一节 放线菌的杀线虫物质的性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验仪器和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌株发酵液的获得
• 1.2.2 杀线虫实验影响因素的排除
• 1.2.3 杀线虫物质的热稳定性测定
• 1.2.4 杀线虫物质的浓缩
• 1.2.5 放线菌产生的小分子挥发性物质的探索
• 2 结果与分析
• 2.1 菌体在作用的排除
• 2.2 放线菌杀线虫物质的热稳定性测定
• 2.3 放线菌杀线虫物质的浓缩
• 2.4 放线菌产生的小分子挥发性物质的探索
• 3. 小结与讨论
• 第二节 植物内生细菌的杀线虫物质的性质研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验仪器和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 内生细菌杀线虫代谢产物稳定性的初步测定
• 1.2.2 硫酸铵分级沉淀法提取杀线虫物质
• 1.2.3 SDS-PAGE法检测杀线虫物质的性质
• 2 结果与分析
• 2.1 杀线虫物质的稳定性测底
• 2.1.1 温度稳定性
• 2.1.2 酸碱稳定性
• 2.1.3 有机溶剂稳定性
• 2.1.4 蛋白酶稳定性
• 2.1.5 耐储藏性
• 2.2 硫酸铵分级沉淀法提取杀线虫物质
• 2.3 SDS-PAGE法检测杀线虫物质的性质
• 3 小结与讨论
• 第五章 具杀线虫活性植物内生细菌的发酵条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验仪器和药品
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 最佳培养时间测定
• 1.2.2 最佳培养基氮源筛选
• 1.2.3 最佳培养基碳源的筛选
• 1.2.4 正交试验
• 2 结果与分析
• 2.1 最佳培养时间分析
• 2.2 最佳培养基氮源筛选
• 2.3 最佳培养基碳源的筛选
• 2.4 正交优化
• 3、小结与讨论
• 第六章 具杀线虫活性植物内生细菌和放线菌的防效实验
• 1 材料与方法
• 1.1 供试材料
• 1.1.1 菌株
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 实验仪器和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 培育番茄苗
• 1.2.2 放线菌对番茄根结线虫的防效实验
• 1.2.3 植物内生细菌对番茄根结线虫的防效实验
• 1.2.4 放线菌和内生细菌对番茄根结线虫的复合防效实验
• 2 结果与分析
• 2.1 放线菌对番茄根结线虫的防效
• 2.2 植物内生细菌对番茄根结线虫的防效
• 2.3 放线菌和植物内生细菌复配对番茄根结线虫的防效
• 3 小结与讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文与研究成果
• 致谢
• 附图