山羊卵丘细胞核移植技术研究

论文摘要

体细胞核移植技术对于动物育种、保种和濒危动物保护、科学实验及发育生物学等基础理论的研究均有重要意义，但目前体细胞克隆成功率较低，已成为制约这一技术应用的主要障碍，因此完善体细胞核移植技术体系，探求核移植机理乃是当前急需解决的问题。本研究探讨了秋水仙碱化学去核法在山羊卵母细胞去核中的应用及其对卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响，并用组蛋白去乙酰化抑制剂—TSA处理核移植供体卵丘细胞及山羊卵母细胞以提高核移植胚胎组蛋白乙酰化水平，探讨了组蛋白乙酰化水平的提高对山羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响。研究发现用秋水仙碱处理山羊体外成熟19h的卵母细胞可使卵母细胞核区形成胞质突起，以此为指示进行显微操作去核率可达100％，且研究发现用0.8μg/ml的秋水仙碱处理30 min山羊卵母细胞突起率可达91.27％，显著高于对照组及0.4μg/ml处理组(P＜0.05)，与1.6μg／ml处理组的突起率差异不显著(P＞0.05)；通过比较盲吸去核法与秋水仙碱化学去核法构建的山羊卵丘细胞核移植胚胎的体外发育能力发现：秋水仙碱化学去核法构建的重构胚桑椹胚发育率显著高于盲吸去核法(P＜0.05)；用不同浓度TSA处理山羊卵丘细胞19h后发现400nM TSA处理组核移植胚胎融合率显著高于对照组(P＜0.05)；用100nM、200nM、400nM TSA处理卵丘细胞19h可不同程度提高山羊核移植胚胎体外发育能力，其中400nM TSA处理组的桑椹胚及囊胚发育率均显著高于对照组(P＜0.05)；用不同浓度TSA处理山羊卵母细胞时发现400nM TSA处理卵母细胞后，重构胚胎的囊胚发育率较对照组明显提高(P＜0.05)；400nM TSA同时处理山羊供体卵丘细胞及卵母细胞时克隆胚胎的体外发育能力明显增强，桑椹胚及囊胚发育率均较对照组有显著提高(P＜0.05)；且400nM TSA单独处理供体卵丘细胞与单独处理卵母细胞时的效果相近，表现在体外培养时两处理组重构胚胎的桑椹胚及囊胚发育率间无明显差异(P＞0.05)。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 哺乳动物核移植技术研究概况
• 1.2 核移植的技术体系
• 1.2.1 核移植受体的准备
• 1.2.2 供核细胞的选择与准备
• 1.2.3 供体细胞的注入与融合
• 1.2.4 克隆后卵母细胞的激活
• 1.2.5 胚胎的体外培养
• 1.3 体细胞核移植相关机理的研究
• 1.3.1 基因组表观重编程
• 1.3.2 核质互作
• 1.4 本研究的目的及主要研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验主要仪器及设备
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要操作液及配制
• 2.1.4 显微操作用去核针的制备
• 2.1.5 显微操作固定针的制备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 山羊卵母细胞的获取与体外成熟
• 2.2.2 受体卵母细胞的选取
• 2.2.3 卵丘细胞单层的制备及供体卵丘细胞的准备
• 2.2.4 卵母细胞的去核与注核
• 2.2.5 卵母细胞胞质与供体卵丘细胞的融合
• 2.2.6 核移植后卵母细胞的激活及处理
• 2.2.7 克隆胚胎的培养
• 2.2.8 数据统计
• 3 结果与分析
• 3.1 不同浓度秋水仙碱对山羊卵母细胞形成突起的影响
• 3.2 不同去核方法对山羊卵母细胞去核率的影响
• 3.3 不同去核方法对山羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 3.4 不同浓度TSA处理山羊卵丘细胞对核移植胚胎融合率的影响
• 3.5 不同浓度TSA处理山羊卵丘细胞对核移植胚胎体外发育的影响
• 3.6 不同浓度TSA处理卵母细胞对克隆胚胎体外发育能力的影响
• 3.7 400NM TSA处理对山羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 4 讨论
• 4.1 化学去核
• 4.2 秋水仙碱在化学去核中的应用
• 4.3 盲吸去核与化学去核的比较
• 4.4 不同浓度TSA处理山羊卵丘细胞对核移植后融合率的影响
• 4.5 不同浓度TSA处理山羊卵丘细胞对核移植胚胎体外发育的影响
• 4.6 不同浓度TSA处理山羊卵母细胞时克隆胚胎体外发育能力的影响
• 4.7 400NM TSA处理对山羊卵丘细胞核移植胚胎体外发育的影响
• 4.8 其他影响因素
• 4.8.1 卵母细胞成熟质量
• 4.8.2 融合与激活间隔时间
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 在读期间发表的论文
• 作者简介
• 致谢
• 附录