人源天然Fab噬菌体抗体库的构建及抗c-Met抗体的筛选、鉴定

论文摘要

上世纪80年代,met作为原癌基因被首次发现。其表达产物c-Met是一类酪氨酸激酶受体,唯一的配体是肝细胞生长因子/扩散因子（HGF/SF）。c-Met在大多数实体肿瘤以及白血病均明显高表达,且与肿瘤临床预后不良高度相关。HGF/SF、c-Met在肿瘤的发生发展、转移过程中起关键作用,可促进肿瘤细胞的增殖、浸润和肿瘤血管生成。c-Met也因此成为抗肿瘤治疗的重要靶点。目前已开展的针对HGF/SF和c-Met的肿瘤治疗包括,反义核酸分子、小分子RNA、HGF/SF拮抗剂NK4、c-Met抑制剂SU11274等,以及抗c-Met或抗HGF/SF的抗体等。抗体由于其对相应靶抗原具有高度的特异性并能偶联其它抗肿瘤药物结合到靶抗原分子而成为抗肿瘤药物研发的热点。在临床治疗中,人抗鼠抗体反应（HAMA）等缺点影响了鼠源性单抗的应用,因此研制全人源抗体成为重要的发展方向。噬菌体抗体库技术是制备全人源抗体的主要技术平台。大容量、具有良好多样性的抗体库,是获得各种人源抗体的有效途径,而且对获得高亲和力抗体以及在对抗体性能进行改造方面具有较强的优势。本文应用噬菌体抗体库技术,克隆出全套人抗体基因,并在噬菌体表面表达,构建大容量人源天然Fab抗体库,从中筛选出特异性抗c-Met全人源Fab抗体片段,为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。研究方法1.取20位健康成人骨髓分离后的淋巴细胞,抽提总RNA,反转录成cDNA。以25对人源抗体基因引物扩增抗体可变区基因;从两个重组载体pComb 3XTT和pComb 3Xλ中将重链CH1、轻链恒定区CL基因分别扩出。再经2轮Overlap-PCR连接得到Fab基因。Fab基因和pComb3XSS载体各经SfiⅠ酶切后,进行二者连接。通过多次电转化导入E.coli.XL1-Blue菌,得到人源天然Fab噬菌体抗体库。2.以固相化蛋白对抗体库进行6轮筛选,随机挑选60个克隆用Phage ELISA进行鉴定。阳性者经BstOI酶切片段分析为不同克隆的,行测序分析,并转化入E.coli.TOP10F’中进行可溶性表达。用Western-blot分析上清和沉淀中的Fab表达情况,ELISA鉴定其特异性。研究结果1.用12对重链基因引物、4对κ链基因引物和9对λ链基因引物扩增出全部抗体可变区基因,再经2轮Overlap-PCR后得到Fab基因片段。经过一百次电转化,获得了库容为1.2×109的人源天然Fab噬菌体抗体库。2.抗体库经过6轮筛选后,噬菌体抗体收获率较第1轮提高5.8×103倍,得到了明显富集。随机挑选60个克隆经Phage ELISA鉴定,4个克隆为阳性。BstOI酶切片段分析它们为同一克隆,命名为AM2-26。测序结果显示为人免疫球蛋白可变区基因。可溶性表达后的上清经western-blot分析证实在相对分子量26kD和30kD左右有二条阳性条带。ELISA鉴定表明AM2-26是与c-Met有特异性结合活性的Fab抗体片段。结论1.成功构建了库容1.2×109的大容量人源天然Fab噬菌体抗体库。2.从中获得1株抗c-Met人源Fab抗体片段,与c-Met有特异性结合活性,为抗肿瘤药物的研制提供新的候选分子。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 人源天然Fab噬菌体抗体库的构建
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 抗c-Met抗体的筛选、鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附录1 综述
• 附录2 中英文对照
• 致谢