论文摘要
目的和意义Rap1GAP属于GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins, GAPs）家族，在Rap1这种小G蛋白GTP-GDP循环中起到重要作用。鸟苷酸交换蛋白（Guanine nucleotideexchange factors, GEPs）使Rap1由结合GDP的非活性状态转化为结合GTP的活性状态，而Rap1GTP的内在水解酶活性很低，需要GAPs加速GTP的水解，使活化的下游信号及时终止。Rap1（Ras-proximate1）是Ras家族中的一员，通过MEK/ERK途径影响细胞的增殖和分化；并调节integrins介导的细胞粘附和迁移，许多研究表明Rap1和肿瘤的关系密切，其上游调节分子也参与了肿瘤的发生发展。近年来在胰腺癌、甲状腺癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤的研究中发现，Rap1GAP在这些肿瘤中表达下调，并且和肿瘤细胞的增殖、迁移相关，Rap1GAP被认为有可能是一潜在的抑癌基因。本实验室的前期研究发现Rap1GAP可能在骨髓增生异常综合征（Myelodysplasticsyndromes, MDS）发病机制中起作用。本试验拟通过构建Rap1GAP慢病毒表达载体转染急性髓系白血病细胞株和动物体内模型来研究Rap1GAP对白血病细胞生物学特性的影响，探讨Rap1GAP在急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia, AML）发病机制中的作用。方法第一部分实时定量PCR检测AML患者、非恶性肿瘤血液病患者骨髓单个核细胞（Bone marrow mononuclear cells, BMNCs）以及AML细胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）Rap1GAP mRNA表达水平，Western Blot检测Rap1GAP蛋白表达水平；用含有BamHI酶切位点的上下游引物将Rap1GAP cDNA克隆至含有黄绿色荧光蛋白（Flavovirens fluorescent protein, YFP）的慢病毒表达载体pRRL-Venus，磷酸钙共沉淀法在293T细胞中进行四质粒系统病毒包装，收集病毒颗粒转染HL-60和NB4细胞，流式分选YFP阳性细胞，有限稀释法筛选出高表达Rap1GAP单克隆阳性细胞株（H1、H2和N1、N2）；MTT法和体外集落培养检测Rap1GAP对细胞增殖能力影响；ATRA和TPA诱导HL-60细胞分化，ATRA诱导NB4细胞分化，24h、48h和72h进行NBT还原试验和流式检测细胞表面抗原CD11b，观察Rap1GAP对细胞分化能力影响；As2O3诱导HL-60和NB4细胞凋亡24h，荧光显微镜观察Rap1GAP对细胞凋亡能力影响；体外跨膜实验和明胶酶谱检测Rap1GAP对细胞体外侵袭力影响。第二部分对4周龄的BALB/c裸鼠进行切脾、环磷酰胺腹腔注射及全身亚致死剂量辐照等预处理后随机分空白对照组（n=5）和实验组（HL-60组、空载体MOCK组、R1组、R2组，每组n=8）。空白对照组经尾静脉注射0.2ml IMDM，实验组经尾静脉接种1.2×107含不同细胞的IMDM液0.2ml，后在层流柜中无菌饲养观察至接种后60天。于裸鼠濒死前或死亡后即行解剖，留取骨髓涂片，瑞氏染色观察有无异常的白血病细胞；各脏器常规病理切片，观察异常白血病细胞在各脏器中的浸润情况；RT-PCR检测裸鼠各脏器中人白血病细胞Rap1GAP和MMP-9基因的表达。结果第一部分①在BMNCs中，AML患者Rap1GAP的mRNA表达水平低于非恶性肿瘤血液病患者（P<.05）。Rap1GAP在AML细胞株（NB4、HL-60、SHI-1和U937）中转录和蛋白水平呈较低表达。②成功构建慢病毒表达载体pRRL-Venus-Rap1GAP，包装出高滴度病毒颗粒，流式检测转染靶细胞效率为80%-90%。RT-PCR和WesternBlot鉴定转染Rap1GAP cDNA的单克隆细胞株HL-60（H1、H2）和NB4（N1、N2）均有外源性Rap1GAP基因的整合和表达。单克隆细胞株H1、H2和N1、N2的Rap1GAP mRNA表达水平各增加16.2、17.3倍和17.5、19.3倍，Rap1GAP蛋白表达水平亦显著增高，Rap1-GTP蛋白显著降低。③细胞生长曲线和体外集落培养亦证实Rap1GAP不影响白血病细胞株HL-60和NB4细胞增殖能力，Western Blot未检测到ERK和p-ERK在Rap1GAP高表达细胞和空载体对照细胞之间的差异。④ATRA诱导HL-60分化过程中，H1和H2单克隆细胞组CD11b表达高于空载体转染对照组，CD11b表达为对照组1.4到2.1倍，24h时CD11b表达差异最为显著。NBT还原实验结果和流式检测CD11b表达相符。TPA诱导HL-60分化48h和72h，H1和H2组表面CD11b显著高于对照组，而24h两组之间无统计学差异。ATRA诱导NB4细胞分化24h、48h，N1、N2组CD11b表达显著增加为对照组1.2到2.0倍，而72h两组之间区别不明显。NBT结果和CD11b表达变化相似。⑤As2O3处理HL-60和NB4细胞24h，Rap1GAP组即可观察到明显的凋亡细胞，而对照组细胞凋亡不明显。⑥Rap1GAP高表达单克隆细胞株H1和H2的侵袭率显著高于对照组HL-60细胞侵袭率（P<.001）。H1和H2分泌更多的MMP-9，而MMP-2在两者之间差别不明显。H1和H2的MMP-9转录水平增加，约为对照组细胞的12倍左右。第二部分空白对照组裸鼠注射后1－2周进食减少、体重下降、消瘦，2周后逐渐恢复正常，生存期大于60天以上无死亡。HL-60组和MOCK组裸鼠尾静脉注射细胞后，亦出现1－2周进食减少、体重下降、消瘦，2周后渐渐恢复，但6周左右再次出现进食减少，消瘦，逐渐衰竭死亡。HL-60组平均存活时间为（44.25±2.12）d，MOCK组平均存活时间为（43.62±2.32）d。R1和R2组裸鼠发病时间较HL-60组提前，注射细胞后4－5周即再次出现进食减少，体重下降，消瘦，衰竭死亡，3只裸鼠出现双下肢瘫痪。R1组平均存活时间（32.00±1.85）d、R2组平均存活时间（33.37±2.50）d。HL-60组和MOCK组裸鼠生存期无差别，R1组和R2组裸鼠较HL-60组生存期缩短（P<.05）。R1组和R2组裸鼠共有3只裸鼠出现脑膜组织浸润，脑膜组织扩增出Rap1GAP和MMP-9基因，部分裸鼠骨髓涂片中检测到人白血病细胞，而其他脏器白血病细胞浸润不明显。HL-60组和MOCK组裸鼠各脏器白血病细胞浸润不明显，未扩增出Rap1GAP和MMP-9基因。结论（1）Rap1GAP在AML患者BNMCs中和急性髓系白血病细胞株（HL-60、NB4、SHI-1和U937）中均低表达。（2）外源性上调Rap1GAP不影响HL-60和NB4细胞增殖能力。（3）外源性上调Rap1GAP促进HL-60和NB4细胞诱导分化能力。（4）外源性上调Rap1GAP降低HL-60和NB4细胞抗凋亡能力。（5）外源性上调Rap1GAP增加HL-60体外和小鼠动物模型体内侵袭能力。综上所述，本研究发现相对于非恶性肿瘤血液病患者Rap1GAP在AML患者BMNCs中低表达，利用慢病毒表达载体上调白血病细胞株HL-60和NB4中Rap1GAP水平（17-19倍），我们发现Rap1GAP不影响HL-60和NB4细胞增殖能力，而促进了ARTA诱导的HL-60和NB4细胞分化及TPA诱导的HL-60分化，而且上调Rap1GAP降低了白血病细胞株HL-60和NB4的抗As2O3诱导凋亡能力。而体外跨膜实验和白血病动物模型结果显示上调Rap1GAP增加HL-60细胞侵袭力。白血病细胞株实验表明Rap1GAP在AML发病过程中可能起到一定作用，具体复杂的作用和机制还需要进一步研究。