四川松针散斑壳菌的种群结构及其遗传分析

论文摘要

松树是北半球最重要的森林树种,在中国的分布遍及全国,包括引进栽培种在内共有38种12变种,四川是全国松树种类最多的省区,有7种2变种,主要有云南松、马尾松、华山松、油松、高山松、湿地松、白皮松、思茅松等。四川林区是青藏高原东部林区的重要组成部分,其森林植被是维系长江流域生态平衡的主要天然屏障。松落针病也是世界常见病害之一,主要危害松树苗木、幼林和成林,轻者引起松树部分松针枯死、脱落,重者可引起70%以上松针枯死脱落,严重影响松树的生长,材积损失率可高达80%,甚至导致松树整株枯死。松落针病也是我国松树林区常见病害,分布广,危害重,长期以来受到学者的高度重视。引起松落针病的病原菌是散斑壳属真菌,该属为斑痣盘菌科中最大一个属,己报道有100多个种,可在多种针叶树和阔叶树上寄生。由于该属真菌分布地域广,寄主种类多,其系统发育及种的分类鉴定也备受人们关注,松树生散斑壳菌的研究也是国内外学者研究的重点。本文是历经多年对四川松树落针病进行调查分析,并着重对松落针病病原菌的种类及其遗传多样性、系统发育关系进行全面系统的研究,以期完善我国松生散斑壳属真菌的研究、为维护四川林区森林健康及松落针病的防控提供科学依据。1.参照Minter提出的松生散斑壳菌形态分类依据,对采自四川近20个市县的样品进行分类鉴定,共鉴定出散斑壳属真菌7种,即针叶树散斑壳（Lophodermium conigenum）、松针散斑壳（LophodermY pinastri）、四川散斑壳（Lophodermium sJchuanense）、印度散斑壳（Lophodermium indianum）、南方散斑壳（Lophodermium australe）、二郎山散斑壳（Lophodermium erlangshanense）（待发表新种）、库茂恩散斑壳（Lophodermiumkumaunicum）。并根据主要形态分类特征提出了四川松生散斑壳菌种的分类检索表。2.以随机采取400颗松针统计针叶上是否有子囊果的方法,对来自四川松树林区29个采样点的样品进行统计分析表明,四川松树林区均有不同程度的落针病发生,其发病率可高达50%以上;针叶树散斑壳、松针散斑壳2个种在云南松、马尾松、湿地松、高山松、华山松上均有出现,且常有混生现象,在云南松、湿地松和马尾松上落地针叶上均有印度散斑壳菌存在,而南方散斑壳菌只在湿地松针叶上出现,库曼散斑壳菌只在高山松上出现,但数量不多;四川散斑壳菌只在二郎山云南松活针叶上有发现,二郎山散斑壳菌只在二郎山和康定跑马山的华山松活针叶和脱落针叶上有发现,数量较少。3.采用子囊果组织分离法对采自四川各地松针散斑壳菌材料进行分离培养,共获得菌株24个（编号L01至L-24）,并对其培养菌落形态特征进行了描述。通过降低养分浓度、改变碳源、更换不同种类的培养基等方法对生长于PDA平板上的散斑壳菌株进行子囊孢子诱发实验,23℃条件下培养60d后均无有性态产生。4.采用改良二次沉淀法和改良氯化苄法提取散斑壳菌培养物总DNA,用于RAPD分析和ITS测序,其结果证明改良后的二种DNA提取法均能满足分析测试要求,改进方法是:在DNA提取之前,将各菌株培养物的菌丝体放入-20℃冰箱冷冻保存12小时以上,然后将冷冻后的菌丝体置于研钵中研磨,再加入相应的提取液。5.从160条RAPD引物中通过初筛、复选,共筛选出11个引物用于24个散斑壳菌株的RAPD分析,并对PCR反应条件进行了优化,其最佳反应条件是:25μlPCR反应体积,10×Taq酶缓冲液（2.5μl）,1.5UTaq酶,20ng DNA模板,0.4 mmol/LdNTPs,4.0mmol/LMg2+,0.48μmol/L引物,10.2μlddH2O。6.利用11个引物对24个菌株进行RAPD分析,共扩增出217个位点,其中多态性位点214个,占总数的98.6%,表明四川散斑壳菌遗传多样性非常丰富。对扩增结果采用UPGMA法进行聚类分析得到24个菌株的相似性系数聚类图。聚类图显示,在相似性系数为0.28处,所有的供试菌株被分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ5类。其中,第1类又可分为Ⅰ-1和Ⅰ-2两个亚类:Ⅰ-1类包含了形态学上具有较多共同特征的L.pinastri、L.conigenum两个种。第Ⅳ类和第Ⅴ类因相似率很低而与其它类群分开,同样也应证了分子生物学与形态学的相关性。将寄主同为马尾松的L.conigenum各菌株单独进行分析,聚类结果显示同一种内各菌株由于地域分隔而产生较大的遗传分化;对来源于泸定二郎山林场的L.pinastri和L.conigenum种内各菌株构建相似性系数矩阵,结果表明,寄主来源不同可能造成种内不同程度的遗传分化。7.利用真菌通用引物ITS1、ITS4成功对18个四川松上散斑壳菌株进行了rDNA的ITS区碱基序列分析,其结果已被GenBank接受注册（AY422489,AY422490,AY515318,AY515319,EU696766,EU696767,EU696768,EU696769,EU696770,EU696771,EU696772,EU696773,EU696774,EU696775,EU696776,EU696777,EU696778,EU679661）。采用DNAstar软件对ITS区序列结果进行多序列比较分析,构建系统发育树。与RAPD分析结果相似,18个菌株可以分成5大组（类）。与Genbank中已注册的欧美国家的9株散斑壳菌ITS区序列结果进行比对分析,其同源率最高为92.9%,四川散斑壳与欧美地区散斑壳菌的同源率较低,仅为70%至80%。综上所述,由于四川林区地理环境复杂、松树种类多,其松落针病病原散斑壳菌多达7种,其中2种为四川报道新种,种间及种内遗传多样性丰富。其形态分类结果与RAPD、rDNA的ITS区碱基序列分析结果有较大的一致性。如何利用现代分子标记技术等手段进行松落针病的病原判定、病害早期诊断和防控是需进一步深入研究的课题。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 松树及其分布
• 1.2 松树落针病及其病原
• 1.2.1 病害症状
• 1.2.2 病害分布及危害
• 1.2.3 松落针病病原及发病规律
• 1.2.3.1 病原菌的确定
• 1.2.3.2 散斑壳菌的生态习性及其致病性
• 1.2.3.3 松落针病发病规律及侵染循环
• 1.3 散斑壳属菌的分类
• 1.3.1 散斑壳属的分类地位及研究进展
• 1.3.2 松针上散斑壳的分类
• 1.4 分子生物学技术在植物病原真菌研究中的应用
• 1.4.1 遗传标记
• 1.4.2 PCR技术
• 1.4.3 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 1.4.4 随机扩增多态性DNA技术（RAPD）
• 1.4.5 核酸序列分析
• 1.4.6 rRNA基因ITS区序列分析在真菌分类鉴定及系统学研究中的应用
• 1.4.6.1 真菌rRNA组成与结构
• 1.4.6.2 ITS区序列分析与真菌分类鉴定
• 1.4.6.3 引物与核糖体核酸序列分析的应用
• 1.5 分子生物学技术在松生散斑壳属真菌研究中的应用
• 1.6 四川松树落针病及其病原菌研究进展
• 1.7 本研究的目的、意义及拟解决的主要问题
• 2 四川松树针叶上散斑壳菌的形态学分类与分离培养
• 2.1 样品的采集与整理
• 2.2 形态学鉴定
• 2.2.1 外部形态观察
• 2.2.2 制片及显微检查
• 2.2.3 描述及绘图
• 2.3 发病率的统计
• 2.4 培养性状的观察及记载
• 2.4.1 病原菌的分离培养
• 2.4.2 培养性状的观察
• 2.5 四川松树针叶上散斑壳菌种的形态描述及种的检索表
• 2.5.1 针叶树散斑壳
• 2.5.2 松针散斑壳
• 2.5.3 四川散斑壳
• 2.5.4 印度散斑壳
• 2.5.5 南方散斑壳
• 2.5.6 二郎山散斑壳
• 2.5.7 库曼散斑壳
• 2.5.8 分种检索表
• 2.6 四川松树林区松落针病发病情况及病原菌
• 2.7 培养性状的记述
• 2.8 人工培养条件下散斑壳菌无有性态产生
• 3 四川松树散斑壳菌的RAPD分子标记及遗传多样性分析
• 3.1 供试菌株
• 3.2 仪器与试剂
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 仪器设备
• 3.3 菌丝体的培养与收集
• 3.4 DNA的提取及检测
• 3.4.1 DNA的提取
• 3.4.2 DNA的检测及定量
• 3.5 基因组DNA的PCR扩增
• 3.5.1 引物的筛选
• 3.5.2 RAPD反应体系的优化
• 3.5.3 反应条件的建立
• 3.5.4 反应产物的检测
• 3.5.5 数据处理
• 3.6 散斑壳菌的RAPD标记与遗传多样性分析
• 3.6.1 DNA的提取及引物的筛选
• 3.6.2 PCR反应条件的优化
• 3.6.2.1 dNTPs浓度对PCR的影响
• 2+浓度对PCR的影响'>3.6.2.2 Mg²⁺浓度对PCR的影响
• 3.6.2.3 DNA模板的量对PCR的影响
• 3.6.2.4 Taq酶用量对PCR的影响
• 3.6.2.5 RAPD引物浓度对PCR的影响
• 3.7 散斑壳菌的RAPD结果分析
• 3.7.1 散斑壳RAPD分析的最佳反应条件
• 3.7.2 扩增图谱的特征
• 3.7.3 遗传相似性的系统聚类分析
• 3.7.3.1 24株散斑壳菌系统聚类分析
• 3.7.3.2 系统聚类与地理来源相关性分析
• 3.7.3.3 系统聚类与寄主的相关性分析
• 4 四川松树散斑壳菌的rRNA基因ITS区的PCR、克隆和序列分析
• 4.1 试验菌株
• 4.2 药品和试剂
• 4.2.1 常规药品及试剂
• 4.2.2 培养基
• 4.2.3 分子生物学试剂
• 4.3 主要仪器设备
• 4.4 实验方法
• 4.4.1 散斑壳真菌细胞总DNA的提取
• 4.4.1.1 不同种散斑壳菌丝体的获得
• 4.4.1.2 散斑壳真菌细胞总DNA的提取
• 4.4.2 散斑壳属不同种rRNA基因ITS区的PCR扩增
• 4.4.2.1 扩增引物
• 4.4.2.2 PCR扩增反应体系
• 4.4.2.3 PCR扩增反应循环
• 4.4.2.4 PCR产物电泳检测
• 4.4.3 不同种散斑壳rRNA基因ITS区的PCR扩增片段的克隆
• 4.4.3.1 PCR扩增DNA片段的纯化和回收
• 4.4.3.2 JM109载体菌感受态细胞的制备
• 4.4.3.3 回收的DNA片段与pUCm-T载体的连接
• 4.4.3.4 重组质粒转入JM109感受态细胞
• 4.4.3.5 阳性克隆菌株的筛选和鉴定
• 4.4.4 克隆片段的DNA序列测定及分析
• 4.4.4.1 DNA序列的测定
• 4.4.4.2 DNA序列的分析
• 4.5 结果与分析
• 4.5.1 散斑壳属不同菌株rRNA基因ITS区序列
• 4.5.2 散斑壳属不同菌株rRNA基因ITS序列的系统发育分析
• 4.6 与不同散斑壳菌株的RAPD聚类结果的对比分析
• 5 讨论与结论
• 5.1 四川松针散斑壳菌的种群结构复杂多样
• 5.2 改良氯化苄法、改良二次沉淀法是散斑壳菌总DNA的提取的有效方法
• 5.3 四川松树上散斑壳菌遗传多样性丰富
• 5.4 四川松针散斑壳属菌株rRNA基因ITS区序列分析
• 6 主要参考文献
• 附图1:四川松树上7种散斑壳菌子囊果外部形态
• 附图2-5:23℃条件下各菌株在PDA培养基上菌落形状
• 附录:已注册并被GenBank接受的四川松针上散斑壳菌rDNA的ITS区序列注册号
• 已发表和待发表相关学术论文
• 致谢