氧化还原电位调控的高浓度乙醇发酵及其机理研究

论文摘要

高浓度（Very high gravity,VHG）发酵能够显著降低燃料乙醇生产过程中的能耗成本,而使用氧化还原电位（Oxidoreduction Potential,ORP）控制能够实现对细胞代谢途径的调控,获得更高的乙醇产量。本文将ORP控制引入VHG乙醇发酵过程中,主要包含以下几方面研究内容：1.优化了VHG乙醇发酵中ORP的控制对批次发酵过程中ORP控制效果做出了分析,结果表明：当ORP设定值为-150 mV时,终点乙醇浓度和发酵效率均最高。同时还发现随底物糖浓度的提高,-150 mV控制下的发酵效率相比没有控制的发酵提高了0.09%、6.09%和7.46%。2.建立了适用于ORP控制的VHG乙醇发酵动力学模型基于批次发酵数据,建立了包含ORP、底物糖浓度S和产物乙醇浓度P的酿酒酵母生长动力学：将该方程与产物生成动力学及底物消耗动力学方程联合求解,能够很好地拟合实验数据。通过动力学模拟,得到初始糖浓度在200-300g/L,ORP控制在100--200 mV的操作图,预测最高发酵终点乙醇浓度为133.2g/L,操作条件为S0=275 g/L,ORP=-140 mV;最佳发酵效率为97.2%,操作条件为S0=235g/L,ORP=-145 mV.3.开发了三种ORP控制方式为使ORP控制更方便地应用于乙醇发酵,开发了通气控制方式（Aeration-controlled Scheme,ACS）,葡萄糖流加控制方式（Glucose-controlled feeding Scheme,GCS）和恒化通气控制方式（Combined Chemostat and aeration-controlled Scheme,CCS）.实验结果证明三种控制方式发酵效果均优于对照组。4.优化了ORP控制恒化发酵过程中熟化罐的设计使用CCS能使ORP控制效果最大化,但面临着残糖消耗不完全的情况。采用恒化罐串联熟化罐的设计,既满足恒化罐内进行ORP控制,维持高的细胞活性,又能使残余葡萄糖在熟化罐内充分利用。合理安排熟化罐的使用时序,可以不影响后续乙醇精馏系统的操作。5.分析了ORP控制下酵母细胞基因表达情况ORP控制的VHG乙醇发酵,酵母细胞受到众多环境胁迫,基因表达进行必要的调控。使用基因微阵列技术,监测了发酵过程中细胞基因组表达情况,发现基因表达的显著变化发生在细胞停滞期到对数生长期（6-12 h）,以及稳定期到衰亡期（30-36 h）的转变点。对数生长前期发生变化的基因涉及各个生理功能,而衰亡期前期表达发生变化的基因主要以胁迫响应为主。详细分析了与糖代谢途径,胁迫响应和呼吸作用有关的基因表达,找出了与ORP变化有相似趋势的基因GPD2和NDI1,有利于解释酵母细胞在基因表达水平上对ORP的响应。6.考查了ORP控制对自絮凝酵母VHG乙醇发酵的影响自絮凝酵母实现了乙醇生产过程中的细胞自固定化,有利于提高乙醇生产强度并且便于细胞与发酵液的分离。ORP控制应用于自絮凝酵母乙醇发酵体系,不仅要考虑到乙醇发酵效果,还需兼顾发酵过程中絮凝颗粒的粒径分布。与游离细胞相比较,絮凝酵母ORP控制时间较长,因此控制效果更明显,最大发酵效率的ORP控制点同样出现在-150mV。同时观察到絮凝性状在不同ORP控制下的改变,其机理可能是ORP控制改变了生物量,葡萄糖和乙醇浓度,间接影响了絮凝颗粒的大小。综上所述,本文监测并控制了高浓度乙醇发酵过程的氧化还原电位,提高了终点乙醇浓度和发酵效率。增强了大宗低附加值的燃料乙醇在经济上的竞争优势,对于实现燃料乙醇的低能耗生产,进一步降低世界对石油资源的依赖性具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 乙醇发酵和氧化还原电位控制研究进展
• 1.1 燃料乙醇生产概述
• 1.1.1 燃料乙醇产业
• 1.1.2 乙醇生产的过程工程
• 1.2 燃料乙醇发展方向
• 1.2.1 新原料的开发使用
• 1.2.2 发酵工艺的革新
• 1.2.3 菌种的改造
• 1.3 氧化还原电位在发酵中的应用
• 1.3.1 氧化还原电位基本理论
• 1.3.2 氧化还原电位的应用
• 1.4 DNA基因微阵列技术
• 1.4.1 基因微阵列的基本原理
• 1.4.2 基因微阵列数据采集和处理
• 1.4.3 基因微阵列数据的应用及网络资源
• 1.5 研究工作的目的和意义
• 2 高浓度乙醇发酵过程中氧化还原电位的变化及最佳控制点
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 菌株与培养基
• 2.2.2 培养方法
• 2.2.3 氧化还原电位的测量与控制
• 2.2.4 发酵液的分析方法
• 2.2.5 发酵参数的定义
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 氧化还原电位的时程变化特点
• 2.3.2 最佳氧化还原条件的确定
• 2.3.3 氧化还原电位控制下的发酵副产物分析
• 2.3.4 氧化还原电位控制对活菌浓度的影响
• 2.4 小结
• 3 氧化还原电位控制下的高浓度乙醇发酵动力学
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验数据获得
• 3.2.2 数据前处理
• 3.2.3 生长动力学模型
• 3.2.4 底物和产物动力学模型
• 3.2.5 参数拟合策略
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 动力学方程组参数的确定
• 3.3.2 动力学方程组拟和效果分析
• 3.3.3 氧化还原电位控制下的高浓度乙醇发酵效果预测
• 3.4 小结
• 4 氧化还原电位控制的高浓度乙醇发酵新工艺的开发
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验数据获得
• 4.2.2 氧化还原电位控制方式
• 4.2.3 发酵装置图
• 4.2.4 发酵效果评价
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 氧化还原电位的通气控制方式
• 4.3.2 氧化还原电位控制终止的原因
• 4.3.3 氧化还原电位的葡萄糖控制方式
• 4.3.4 氧化还原电位的恒化通气控制方式
• 4.3.5 几种氧化还原电位的控制方法的对比
• 4.4 小结
• 5 氧化还原电位控制的恒化发酵过程中熟化罐的设计
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验数据获得
• 5.2.2 恒化罐与熟化罐的设置
• 5.2.3 稀释速率的选择
• 5.2.4 发酵效果的数学分析方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 熟化罐中的发酵情况
• 5.3.2 熟化罐的设计和操作时序安排
• 5.3.3 氧化还原电位控制条件下的批次与连续过程对比
• 5.3.4 发酵参数对发酵效果的影响
• 5.3.5 最小需求时间和发酵方式的选取
• 5.3.6 恒化-熟化设计与传统连续反应器设计的比较
• 5.4 小结
• 6 氧化还原电位控制的高浓度乙醇发酵中酵母基因表达分析
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 发酵实验方法
• 6.2.2 RNA的提取
• 6.2.3 cDNA的荧光直接标记
• 6.2.4 在基因微阵列上的杂交
• 6.2.5 微阵列的图像处理
• 6.2.6 微阵列数据分析
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 发酵情况说明
• 6.3.2 基因表达总览
• 6.3.3 各系统基因表达情况
• 6.3.4 糖代谢相关基因表达情况
• 6.3.5 压力响应相关基因表达情况
• 6.3.6 呼吸作用相关基因表达情况
• 6.4 小结
• 7 氧化还原电位控制对自絮凝酵母高浓度乙醇发酵的影响
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 菌种和培养基
• 7.2.2 培养方法
• 7.2.3 ORP控制方式
• 7.2.4 分析方法
• 7.2.5 絮凝颗粒酵母表征方法
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 发酵过程总览
• 7.3.2 ORP控制曲线变化
• 7.3.3 生物量分析
• 7.3.4 发酵效果的对比
• 7.3.5 通气量影响的分析
• 7.3.6 细胞絮凝能力对比
• 7.4 小结
• 结论及展望
• 创新点摘要
• 参考文献
• 附录A 符号说明
• 作者简介
• 攻读博士学位期间发表学术论文情况
• 致谢