家蚕bHLH转录因子家族成员鉴定及其基因的电子克隆

论文摘要

bHLH（basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋）转录因子构成了真核生物蛋白质中的一个大家族,其成员在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用。bHLH基序约含60个氨基酸,由一个能与DNA结合的碱性区域（basic region）和α螺旋1-环-α螺旋2（Helix 1-Loop-Helix 2）组成,其中环的长度在不同bHLH蛋白中会有差异。自从1989年第一个bHLH蛋白的结构被解析以来,迄今为止已经有近1000条bHLH序列在不同生物中得到鉴定。动物bHLH因其调控基因表达的功能不同而被分成45个家族;此外,根据它们所作用DNA元件和自身结构特点又被分成6个组。A组包含22个家族,主要调控神经细胞生成、肌细胞生成和中胚层形成;B组包含12个家族,主要调控细胞增殖与分化、固醇代谢与脂肪细胞形成以及葡萄糖响应基因的表达;C组包含7个家族,主要负责调控中线与气管发育、昼夜节律、激活环境毒素响应基因的转录;D组只有1个家族,它与A组bHLH蛋白形成无活性的异源二聚体;E组有2个家族,调控胚胎分节、体节形成与器官发生等;F组也只有1个家族,调控头部发育、嗅觉神经元生成等。迄今为止,生物基因组中的bHLH家族成员数得到鉴定的动物共有15种,其中,人类118个、小鼠102个、河豚84个、文昌鱼78个、星形海葵68个、帽贝63个、Capitella sp.Ⅰ64个、果蝇59个、水蚤57个、紫海胆50个、红粉甲虫50个、玻璃海鞘46个、线虫39个、水螅33个、海绵16个。家蚕是重要的鳞翅目模式昆虫,家蚕基因组测序工作在2003年10月即已完成,而对于其中有多少个bHLH家族成员还未有报道。本研究采用生物信息学方法开展“家蚕bHLH转录因子家族成员的鉴定及其基因的电子克隆”方面的探索,目的在于鉴定出家蚕中bHLH转录因子家族成员的数目,并初步弄清家蚕中编码bHLH转录因子的基因结构。主要结果如下:1、家蚕基因组中存在52个bHLH转录因子编码区域,这一结果与其它昆虫中的bHLH数目相近。其中,在12个家蚕bHLH基序的编码区域中有内含子,1个家蚕bHLH基序在基因组中存在两个为其编码的区域,分别位于Ctg038409和Ctg063456上。2、家蚕52个bHLH转录因子成员的分组及其家族归属情况为:A组21个,分别为BmASCa1、BmASCa2、BmASCa3、BmASCa4、BmMyoD、BmE12/E47、BmNgn、BmAtonal、BmMist、BmBeta3、BmNet、BmDeliah、BmMesp、BmTwist、BmParaxis、BmMyoRa、BmHand、BmPTFa、BmPTFb、BmSCL和BmNSCL;B组10个,分别为BmSRC、BmMyc、BmMnt、BmMax、BmUSF、BmMITF、BmSREBP、BmAP4、BmMLX和BmTF4;C组12个,分别为BmClock1、BmClock2、BmClock3、BmARNT、BmBmal1、BmBmal2、BmAHR1、BmAHR2、BmAHR3、BmSim、BmTrh和BmHIF;D组1个,即BmEmc;E组7个,分别为BmHey1、BmHey2、BmH/E（spl）1、BmH/E（spl）2、BmH/E（spl）3、BmH/E（spl）4和BmH/E（spl）5;F组1个,即BmCOE。在家蚕基因组中没有发现编码ASCb、NeuroD、Oligo、MyoRb、Figα和Mad家族bHLH蛋白的区域。3、应用电子克隆方法绘制出了11种家蚕bHLH的基因结构,分别是:BmASCa4、BmAtonal、BmBeta3、BmMesp、BmTwist、BmParaxis、BmMyoRa、BmMyc、BmUSF、BmEmc和BmH/E（spl）4;另外,对5种家蚕bHLH蛋白（BmMLX、BmTF4、BmClock1、BmARNT和BmHIF）的编码区域有了一定的了解。4、预测出了5种家蚕bHLH蛋白的功能,具体为:BmASCa4由l’sc基因编码,具有促进神经前体形成的功能;BmAtonal由αto基因编码,具有调控弦音器与光感受器形成的功能:BmTwist的作用是控制中胚层谱系分化以及抑制MyoD转录因子的功能;BmMyoRa的功能是抑制肌肉细胞的生成;BmEmc与其它bHLH蛋白形成无DNA结合能力的异型二聚体来对生长发育过程实施负调控。5、本研究还还对人类、大鼠、小鼠、红粉甲虫、果蝇、埃及伊蚊、非洲疟蚊、蜜蜂、鸡、蟾蜍、斑马鱼和海胆的emc基因做了电子克隆。从它们的结构上看,随着生物进化程度的提高,emc基因的外显子和内含子长度似乎有逐步缩短的趋势,倾向于支持内含子早现说。本研究所获得的结果为今后开展家蚕生长发育调控机理方面的研究积累了基础资料,也为进一步开展这些基因的表达谱分析、不同物种间bHLH基因结构与功能的比较等方面的探索打下了良好基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 图表清单
• 英文缩写词表
• 第一章 bHLH转录因子家族研究进展
• 1.1 bHLH蛋白自然分类法的提出
• 1.2 bHLH蛋白的预测基序
• 1.3 生物基因组中bHLH家族成员的鉴定与家族分类的拓展
• 1.4 bHLH转录因子的系统发生
• 1.5 动物bHLH转录因子的主要功能
• 1.6 植物bHLH转录因子家族
• 1.7 展望
• 1.8 本章小结
• 第二章 研究目的、研究内容和技术路线
• 2.1 研究目的
• 2.2 研究内容
• 2.3 技术路线
• 2.4 本章小结
• 第三章 家蚕bHLH转录因子家族成员鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 45个家族bHLH基序与59条果蝇bHLH基序
• 3.1.2 tblastn搜索
• 3.1.3 搜索结果整理
• 3.1.4 末端补齐
• 3.1.5 内含子分析
• 3.1.6 保守氨基酸位点检查
• 3.1.7 多序列比对
• 3.1.8 系统发生分析
• 3.1.9 保守位点标记
• 3.1.10 家蚕bHLH基因的染色体定位
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 家蚕bHLH转录因子成员
• 3.2.2 家蚕bHLH基序的编码区域
• 3.2.3 直系同源家族的确定
• 3.2.4 家蚕bHLH转录因子家族成员的命名与分类
• 3.2.5 家蚕bHLH基因在染色体上的位置
• 3.3 讨论
• 3.3.1 昆虫bHLH转录因子成员的比较
• 3.3.2 bHLH转录因子家族归属的判断
• 3.3.3 组内系统发生分析的优点
• 3.3.4 家蚕bHLH成员数目
• 3.4 本章小结
• 第四章 家蚕bHLH转录因子基因的电子克隆
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 家蚕bHLH基序
• 4.1.2 第一轮tblastn搜索
• 4.1.3 第一轮EST序列装配
• 4.1.4 第二轮tblastn搜索与EST装配
• 4.1.5 blastn搜索
• 4.1.6 内含子分析
• 4.1.7 基因结构图绘制
• 4.1.8 GenScan与GeneBuilder
• 4.1.9 家蚕bHLH结构域分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 家蚕BmASCa4的基因结构
• 4.2.2 家蚕BmAtonal的基因结构
• 4.2.3 家蚕BmBeta3的基因结构
• 4.2.4 家蚕BmMesp的基因结构
• 4.2.5 家蚕BmTwist的基因结构
• 4.2.6 家蚕BmParaxis的基因结构
• 4.2.7 家蚕BmMyoRa的基因结构
• 4.2.8 家蚕BmMyc的基因结构
• 4.2.9 家蚕BmUSF的基因结构
• 4.2.10 家蚕BmEmc的基因结构
• 4.2.11 家蚕BmH/E（spl）4的基因结构
• 4.3 讨论
• 4.3.1 家蚕BmbHLH基因
• 4.3.2 物种间bHLH基因结构的比较
• 4.4 本章小结
• 第五章 家蚕bHLH转录因子的功能
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 家蚕bHLH转录因子的氨基酸序列
• 5.1.2 blastp搜索与序列提取
• 5.1.3 多序列比对
• 5.1.4 系统发生分析
• 5.1.5 保守位点标记
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 家蚕BmASCa4转录因子的功能
• 5.2.2 家蚕BmAtonal转录因子的功能
• 5.2.3 家蚕BmBeta3转录因子的功能
• 5.2.4 家蚕BmMesp转录因子的功能
• 5.2.5 家蚕BmTwist转录因子的功能
• 5.2.6 家蚕BmMyoRa转录因子的功能
• 5.2.7 家蚕BmMyc转录因子的功能
• 5.2.8 家蚕BmUSF转录因子的功能
• 5.2.9 家蚕BmEmc转录因子的功能
• 5.3 讨论
• 5.4 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 研究结论
• 6.1.1 家蚕52个bHLH家族成员
• 6.1.2 家蚕bHLH成员家族归属的判断
• 6.1.3 家蚕bHLH基因的染色体定位
• 6.1.4 家蚕bHLH家族成员的基因结构
• 6.1.5 家蚕bHLH蛋白功能的预测
• 6.1.6 不同物种emc基因结构的比较
• 6.2 研究展望
• 6.2.1 家蚕bHLH基因的克隆
• 6.2.2 家蚕bHLH基因的表达谱
• 6.2.3 家蚕多成员bHLH家族的系统发生
• 6.2.4 家蚕bHLH转录因子的功能
• 参考文献
• 论文的主要创新点
• 致谢
• 博士期间发表论文和参加课题
• 发表论文
• 参加课题
• 详细摘要