与DNA硫修饰相关的DndB蛋白的表达纯化和结晶

论文摘要

DNA硫修饰是近年来发现的一种广泛存在于原核生物中的新的DNA修饰现象,研究发现DNA硫修饰是由5个基因决定的,分别是dndA、dndB、dndC、dndD、dndE,这5个基因位于一个基因簇上,分别编码5种对应的蛋白质:DndA,DndB,Dnd C,DndD,Dnd E。本研究主要探讨了DndB的纯化结晶、不同片段构建以及DndA和DndE的纯化工作。Salmonella enterica serovar Cerro 87中的DndB蛋白（Salm-DndB）拥有361个氨基酸残基,相对分子质量约为41kDa,研究表明DndB蛋白和一些转录调节因子具有序列相似性,似乎可以和DNA结合来决定修饰位点的特异性。本研究重点表达纯化了Salm-DndB蛋白,获得了纯度足够高的Salm-DndB蛋白,尝试对其进行了结晶,并且如愿获得了Salm-Dnd B蛋白的晶体,但是晶体是针状晶体,晶体质量不好,不可以进行X-Ray衍射。Salm-DndB蛋白的晶体经过优化之后,其形状和大小都得到改善,但是还是没有得到可以衍射的晶体。后来研究中发现Salm-Dnd B蛋白的晶体发生了降解,最终会降解成2个独立稳定的条带,蛋白质质谱分析以及N端测序确定大的降解条带是172-361,小的降解条带没能确定氨基酸序列,用1-171来取代,于是构建了Salm-DndB 1-171以及172-361的表达载体,但是最后没有得到可以表达的蛋白质。同时,本研究根据Salm-DndB FoldIndex蛋白质折叠性预测构建了Salm-Dnd B 1-312和Salm-DndB 108-361蛋白片段的表达载体,根据蛋白序列保守性构建了Salm-Dnd B 54-361蛋白片段的表达载体,最终Salm-Dnd B 54-361蛋白片段没有得到可溶性的表达;Salm-Dnd B 108-361蛋白片段获得了少量的表达。另外,对于DndA蛋白,本研究纯化了Streptomyces lividans 66中的Strep-DndA蛋白,获得了高纯度的蛋白用于后续研究;对于DndE蛋白,本研究表达纯化了E.coli B7A中的B7A-DndE蛋白,蛋白经过分子筛纯化后纯度很高,但是均一性比较差。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 绪论
• 1.1 DNA的修饰现象
• 1.2 DNA硫修饰现象的发现
• 1.3 DNA硫修饰的化学本质以及特异性
• 1.4 DNA硫修饰相关基因的分析
• 1.5 DNA硫修饰相关蛋白质的分析
• 1.6 蛋白质结构生物学简介
• 1.7 蛋白质的纯化方法
• 1.7.1 蛋白质的亲和层析
• 1.7.2 蛋白质的离子交换层析
• 1.7.3 蛋白质的凝胶过滤层析
• 1.8 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 主要实验仪器
• 2.2 试验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 质粒
• 2.2.3 主要实验试剂
• 2.3 引物序列
• 2.4 主要试剂的配制
• 2.4.1 培养基和化学试剂的配制
• 2+-NTA柱亲和层析、阴离子交换层析和Superdex 200分子筛层析的缓冲液配制'>2.4.2 Ni²⁺-NTA柱亲和层析、阴离子交换层析和Superdex 200分子筛层析的缓冲液配制
• 2.4.3 研究中所用抗生素
• 2.5 试验方法
• 2.5.1 引物的设计
• 2.5.2 引物的合成
• 2.5.3 引物的前期准备
• 2.5.4 目的基因的克隆
• 2.5.5 电泳检测PCR反应产物以及凝胶回收
• 2.5.6 目的基因和质粒的内切酶双酶切以及连接反应
• 2.5.7 转化感受态细胞
• 2.5.8 质粒的小规模抽取
• 2.5.9 目的蛋白的表达及可溶性检测
• 2+-NTA柱亲和层析纯化'>2.5.10蛋白质的Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化
• 2.5.11蛋白质Source 15Q离子交换层析纯化
• 2.5.12蛋白质浓缩
• 2.5.13蛋白质的Superdex 200分子筛层析纯化
• 2.5.14蛋白晶体的筛选方法
• 2.5.15蛋白质的PVDF膜转膜实验
• 第三章 DndB蛋白的表达、纯化与结晶
• 3.1 Salm-DndB蛋白的表达纯化
• 2+-NTA柱亲和层析纯化'>3.1.1 Salm-Dnd B Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化
• 3.1.2 TEV酶切除NusA标签
• 3.1.3 Salm-Dnd B Source 15Q阴离子交换层析纯化
• 3.1.4 Salm-Dnd B Superdex 200分子筛层析纯化
• 3.2 TEV酶的纯化
• 2+-NTA柱亲和层析纯化'>3.2.1 TEV酶的Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化
• 3.2.2 TEV酶的Superdex 200分子筛层析
• 3.3 Salm-DndB蛋白晶体的筛选及优化
• 3.3.1 Salm-Dnd B蛋白结晶条件初筛
• 3.3.2 Salm-Dnd B蛋白晶体的优化
• 3.4 Salm-DndB蛋白的降解
• 3.5 Salm-DndB 1-171、172-361片段表达载体的构建
• 3.5.1 Salm-Dnd B 2 个降解条带质谱分析和N端测序
• 3.5.2 Salm-Dnd B 1-171、172-361表达载体构建
• 3.5.3 结果分析
• 3.6 Salm-DndB 1-312片段表达载体的构建
• 3.6.1 Salm-Dnd B FoldIndex蛋白折叠倾向性预测
• 3.6.2 Salm-Dnd B 1-312表达载体的构建
• 3.6.3 结果分析
• 3.7 Salm-DndB 54-361片段表达载体的构建
• 3.7.1 Salm-Dnd B蛋白序列同源性比对
• 3.7.2 Salm-Dnd B 54-361片段表达载体的构建
• 3.7.3 结果分析
• 3.8 Salm-DndB 108-361片段表达载体的构建
• 3.8.1 Salm-Dnd B 108-361 FoldIndex蛋白折叠倾向性预测
• 3.8.2 Salm-Dnd B 108-361表达载体的构建
• 3.8.3 结果分析
• 3.9 本章小结
• 第四章 DndA蛋白的表达纯化
• 4.1 Strep-DndA蛋白的表达纯化
• 2+-NTA柱亲和层析纯化'>4.1.1 Strep-DndA蛋白Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化
• 4.1.2 凝血酶切除His-Strep-DndA蛋白中的组氨酸标签
• 4.1.3 Strep-DndA蛋白Superdex 200分子筛层析纯化
• 4.1.4 结果分析
• 4.2 本章小结
• 第五章 DndE蛋白的表达纯化
• 5.1 B7A-DndE蛋白的表达纯化
• 2+-NTA柱亲和层析纯化'>5.1.1 B7A-DndE蛋白Ni²⁺-NTA柱亲和层析纯化
• 5.1.2 B7A-DndE蛋白Superdex 200分子筛层析纯化
• 5.1.3 结果分析
• 5.2 本章小结
• 第六章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表和接收的学术论文目录