副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1.7产肽条件优化及肽类分离研究

论文摘要

由乳酸菌产生的抗菌肽（antibacterial-peptides，ABP）作为新一代食品防腐剂，具有安全性好、生产成本低等特点，越来越受到人们的重视。副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）HD1．7产生的抗菌肽，对多种革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌以及酵母菌都有抑制作用，同时具有耐高温等特点，可作为新型食品防腐剂。本文对副干酪乳杆菌HD1．7所产抗菌肽进行了研究，优化其培养基成分以提高其产肽量，对其产生的抗菌肽进行了分离纯化，并对其生物学特性进行了初步探索。这些研究为该菌投入生产，广泛应用于食品药品、探讨抗菌肽对指示菌的作用位点、以及研究抗菌肽基因的克隆表达等工作奠定了基础。本研究通过以廉价的工业原料取代高成本的实验室原料，对副干酪乳杆菌HD1．7培养基成分进行比较，确定该菌产抗菌肽的最佳发酵培养基配方为：工业蛋白胨30g／L，葡萄糖10g／L，磷酸氢二钾1．5g／L，亚硫酸钠0．2g／L，乙酸钠7g／L，硫酸镁0．1g／L，硫酸锰0．025g／L，吐温-80 1．0mL／L，调节pH5．5。对副干酪乳杆菌HD1．7抗菌肽进行分离纯化，通过阳离子交换层析（CMSepharose Fast Flow）按照抗菌肽在溶液中的离子特性对其初步分离；对有抑菌活性的组分依据分子量大小不同，利用凝胶层析（Sephadex G-25、G-10）进行逐层分离。共分离得到5个活性组分，G10a，G10b，G10c，G10d和G10e，其中G10d的效价最高。根据SDS-PAGE结果，估测此抗菌肽分子量小于10kDa。抗菌肽的生物学特性研究表明，副干酪乳杆菌HD1．7抗菌肽在酸性条件下抑菌活性高，在pH4．0时，抑菌活性最高；具有很好的热稳定性，在121℃处理15min仍有抑菌活性；它不仅抑制革兰氏阳性菌，还能抑制革兰氏阴性菌，对酵母菌也有抑制作用，有很广的抑菌谱；该抗菌肽对胰蛋白酶敏感，但对胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、K蛋白酶不敏感。该抗菌肽可抑制枯草芽孢杆菌的生长，但不能杀死细菌。粗产物在4℃长期保存仍具有很强的抑菌活性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 乳酸菌
• 1.2 乳酸菌抗菌肽
• 1.2.1 乳酸杆菌产生的抗菌肽
• 1.2.2 乳酸球菌产生的抗菌肽
• 1.3 乳酸菌抗菌肽的分类及作用机制
• 1.4 乳酸菌抗菌肽的应用
• 1.4.1 在食品方面的应用
• 1.4.2 在医药方面的应用
• 1.5 乳酸菌抗菌肽发酵条件的研究
• 1.5.1 培养基成分对抗菌肽产量的影响
• 1.5.2 培养方式对抗菌肽产量的影响
• 1.6 乳酸菌抗菌肽分离纯化的研究
• 1.6.1 层析技术
• 1.6.2 蛋白质定性和定量分析技术
• 1.6.3 蛋白质的鉴定-质谱分析
• 1.6.4 用肽质量指纹图谱鉴定蛋白质
• 1.7 本研究的目的和意义
• 1.8 本研究的主要技术路线
• 第2章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要试剂及药品
• 2.1.4 试剂盒
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 种子液的制备
• 2.2.2 发酵上清液（样品）的制备
• 2.2.3 抑菌活性的检测
• 2.2.4 乳酸对抑菌效果的影响
• 2.2.5 抗菌肽效价的确定
• 2.2.6 菌体生长及产抗菌肽动态变化过程的研究
• 2.2.7 菌株产抗菌肽培养基成分优化
• 2.2.8 抗菌肽分离纯化研究
• 2.2.9 抗菌肽生物学特性的研究
• 第3章 结果与分析
• 3.1 乳酸对抑菌效果的影响
• 3.2 副干酪乳杆菌HD1.7产抗菌肽效价标准曲线的绘制
• 3.3 菌体生长及产抗菌肽动态变化过程的研究
• 3.4 菌株产抗菌肽发酵条件优化
• 3.4.1 发酵培养基成分氮源及碳源的确定
• 3.4.2 培养基中其他成分的确定
• 3.5 抗菌肽分离纯化研究
• 3.5.1 最大吸收波长的确定
• 3.5.2 弱阳离子交换层析
• 3.5.3 凝胶层析
• 3.5.4 高效液相色谱
• 3.5.5 蛋白浓度测定
• 3.5.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.6 抗菌肽生物学特性的研究
• 3.6.1 不同pH对抗菌肽粗提产物活性的影响
• 3.6.2 抗菌肽粗提产物的热稳定性
• 3.6.3 抗菌肽的抑菌谱及最低抑菌浓度
• 3.6.4 抗菌肽对不同蛋白酶的敏感性
• 3.6.5 抗菌肽的作用方式
• 3.6.6 抗菌肽粗提产物保质期对效价的影响
• 第4章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢