论文摘要
研究背景原发性肝癌是世界常见的恶性肿瘤之一,也是我国的高发恶性肿瘤,由于不易被早期诊断,进展迅速,术后容易复发、转移,因此预后较差。目前肝癌仍以外科手术为公认首选和主要的治疗手段,但由于很多患者肝癌确诊时已是中晚期,失去了手术治疗的机会并于诊断后1年内死亡,手术切除率＜30%,术后总体5年生存率仅30%～40%。对于可手术的肝癌患者,术后复发、转移是影响治疗效果及预后的主要因素,对于不能手术的中晚期肝癌患者尚缺乏有效的治疗方法。传统的化疗、放疗对肝癌疗效欠佳,目前仍缺乏行之有效的化学预防和治疗靶位。有必要寻找新的治疗手段和药物。分子靶向药物是肿瘤治疗研究的一个新领域,由于这类药物作用的高选择性以及较小的副作用,分子靶向药物成为了近年来抗癌药物研究的热点和发展趋势,也是提高肝癌治疗效果的研究方向之一。多靶点药物索拉非尼通过抑制c-RAF和b-RAF的丝氨酸/苏氨酸激酶活性,抑制血管内皮生长因子-2（VEGFR-2）、血管内皮生长因子-3（VEGFR-3）以及血小板源生长因子-β（PDGFR-β）、FLT3和c-KIT的酪氨酸激酶的活性,分别在生长因子与其膜受体结合和细胞内信号传导两个水平上阻断肿瘤血管生成和肿瘤细胞的增殖,能有效抑制肝癌的生长和血管形成,在临床前试验及临床试验中显示出抗肝癌效应。生物化疗（Biochemotherapy）,是生物治疗和化学治疗联合应用于肿瘤治疗的全新综合治疗模式,是生物治疗和化疗的有机结合。它是根据肿瘤的病理类型、临床分期、发生部位和发展趋势,结合患者的全身情况和分子生物学行为,有计划地联合应用化疗药物和生物制剂进行治疗,以取得最好的治疗效果,达到最大限度地改善病人生存质量的目的。目前成为肿瘤治疗的第四模式。分子靶向药物与化疗药物联合即是其方式之一。临床前研究及临床试验表明,索拉非尼与化疗药物联用可以取得更好的抗瘤效果,甚至使已经化疗进展或产生耐药的病人达到病情稳定较长时间。顺铂（cisplatin,DDP）在多种实体瘤的治疗中显示了确切的疗效,而且临床病人耐受性好。二者不同的作用机制有可能使索拉非尼和顺铂联合取得明显增强的抗肿瘤效果,这一点已被索拉非尼的临床前研究证实。因而本课题旨在研究索拉非尼联合顺铂在体内外抑制肝癌细胞生长的作用,试图为探索生物化疗模式治疗肝癌的新思路提供实验依据。研究目的本课题旨在研究靶向药物索拉非尼与化疗药物顺铂联合对人肝癌HepG2细胞生长的抑制作用,并探讨其可能的效应机制。通过对细胞凋亡相关分子、细胞信号转导相关分子的检测从分子水平和细胞信号传导方面探讨二者联合的可能分子机制;并应用荷瘤裸鼠动物模型研究不同于体外的体内抗血管生成机制。研究方法第一章索拉非尼联合顺铂对HepG2细胞体外生长的抑制作用1.肝癌细胞体外传代培养,细胞培养至对数生长期后实验细胞分为4组:分别为空白对照组、索拉非尼单药组、顺铂单药组、索拉非尼联合顺铂组。检测细胞增殖抑制率时索拉非尼药物剂量分别为2、4、8、16μmol/L;顺铂药物剂量分别为3、6、12、24μmol/L;索拉非尼联合顺铂组药物剂量是（2+3）、（4+6）、（8+12）μmol/L。检测细胞周期和凋亡时,组中药物剂量索拉非尼均为4μmol/L,顺铂均为6μmol/L。2.以MTT法检测24、48、72h时间点药物抑制人肝癌细胞HepG2增殖的作用,根据OD值计算细胞生长抑制率。采用协同作用q值判断索拉非尼和顺铂联用的性质:q＞1.15为协同作用,0.85≤q≤1.15为相加作用,q＜0.85为拮抗作用。3.用流式细胞仪于药物作用后24、48h分别检测细胞周期与凋亡,并计算凋亡率。电子透射显微镜观察凋亡细胞超微结构。第二章索拉非尼联合顺铂抑制HepG2细胞生长机制的初步探讨1.细胞培养及分组同上,用激光共聚焦显微镜JC-1染色及流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位变化;2.Western-Blot法检测各组细胞凋亡相关分子Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、procaspase-3蛋白表达:Western-Blot法检测各组细胞pERK 1/2、ERK1/2、JNK1/2的表达水平。3.分光光度法检测药物作用后细胞caspase-3活性。第三章索拉非尼联合顺铂增强抗肿瘤效应体内机制的初步探讨建立肝癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,将50只荷瘤裸鼠随机分成4组,空白对照组、溶剂对照组、索拉非尼单药组、顺铂单药组、索拉非尼联合顺铂组。观察移植瘤生长情况,自用药后第21天处死荷瘤裸鼠,剥离并收集皮下移植瘤,肿瘤组织HE染色观察病理学变化情况,免疫组织化学法检测各组移植瘤组织的微血管密度（MVD）及VEGF表达情况。注:统计分析:所有数据采用SPSS 11.5统计软件进行统计处理,实验数据用均数±标准差（（?）±s）表示,各组间细胞抑制率比较采用定量数据重复测量方差分析:其余均采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法,方差不齐的采用Tamhane’s T2法;显著性标准为α=0.05。P＜0.05有统计学意义。研究结果第一章索拉非尼联合顺铂对HepG2细胞体外生长的抑制作用1.MTT比色法结果显示,不同浓度索拉非尼和顺铂单独处理HepG2细胞,增殖抑制程度随着药物浓度和作用时间的增加呈现增强的趋势,表现为时间剂量依赖效应（P＜0.01）;各浓度单独和联合应用之间的细胞抑制率有显著性差异（P＜0.01）;不同时间各浓度联合组与索拉非尼及顺铂单药组抑制率均有显著性差异（P＜0.01）,联合组疗效优于单药组。2.索拉非尼和顺铂不同浓度联合作用的q值结果显示,不同浓度索拉非尼和顺铂联合用药组在72小时均显示出相加作用（0.85≤q≤1.15）。索拉非尼4μmol/L和顺铂6μmol/L联合用药组在各个时间点均显示相加作用（0.85≤q≤1.15）。3.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率显示,索拉非尼及顺铂单药作用均可使细胞周期阻滞于G0/G1期,与对照组相比有显著性差异,P值分别为0.002和0.032:联合用药组G0/G1期细胞比率高于单药组（P=0.025,0.002）,S期细胞比率低于单药组（P=0.004,0.022）。索拉非尼或顺铂单药作用后,细胞凋亡率均较对照组升高（P＜0.05）。与索拉非尼和顺铂单药组相比,联合用药组凋亡率升高更为明显,达35.28%（P=0.007,0.001）。4.透射电镜显示,药物处理组细胞存在较多凋亡细胞,可见细胞核固缩、边集、碎裂等凋亡改变。第二章索拉非尼联合顺铂抑制HepG2细胞生长机制的初步探讨1.线粒体跨膜电位测定,流式细胞仪结果显示,药物处理组的荧光强度较对照组明显降低（P＜0.05）,且联合用药使荧光强度降低更为明显,与另外三个组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明单独使用顺铂和索拉非尼能使细胞线粒体跨膜电位降低,联合作用强于单药。共聚焦显微镜结果显示,用药组绿色荧光增强,红色荧光减弱,联合组强于单药组。2.Western-Blot结果显示:（1）单独应用索拉非尼能抑制ERK磷酸化,索拉非尼和顺铂联合可以进一步减少pERK的水平,作用强于索拉非尼单药,有统计学意义（F=567.365,P=0.000）。药物作用后对总的ERK蛋白水平无显著性影响（F=0.170,P=0.914）。顺铂和索拉非尼单独及联合都能使pJNK增多,高于对照组,（F=12.281,P=0.002）,但是联合用药没有更强的作用（P＞0.05）。（2）顺铂和联合用药显著下调Bcl-2蛋白的表达（F=20.837,P=0.000）,索拉非尼对Bcl-2蛋白水平无明显影响（P=0.476）,联合应用索拉非尼后,对顺铂下调Bcl-2蛋白的作用并未出现增强或减弱（P=0.791）。（3）索拉非尼和顺铂单药可以降低Bcl-xL蛋白的表达,联合用药进一步降低了该蛋白的表达,差异有显著性（F=35.185,P=0.000）。（4）Mcl-1蛋白的表达结果显示,索拉非尼组和联合组Mcl-1的表达低于顺铂组和对照组（F=57.434,P=0.000）,顺铂组和对照组未见显著性差异,索拉非尼组和联合组无显著性差异。（5）procaspase-3的表达对照组最高,联合用药组最低（F=492.127,P=0.000）。表明,单独应用索拉非尼和顺铂能活化caspase-3,使procaspase-3水解为caspase-3而减少,联合可以进一步减少procaspase-3的水平,作用强于索拉非尼单药。3.分光光度法显示,caspase-3的活性对照组最低,联合用药组最高（F=492.127,P=0.000）。表明,单独应用索拉非尼和顺铂能活化caspase-3,联合可以进一步活化caspase-3的水平,作用强于索拉非尼单药。第三章索拉非尼联合顺铂增强抗肿瘤效应体内机制的初步探讨1.动物试验结果显示,空白对照组及溶剂对照组肿瘤生长均较快,索拉非尼及顺铂单药能抑制裸鼠移植瘤的生长,肿瘤生长较对照组缓慢,联合用药组肿瘤生长最缓慢。五组裸鼠皮下移植瘤瘤重差异有显著性（F=90.043,P＜0.001）:不同处理后的瘤重有显著性差异（F=136.233,P＜0.001）:不同时间的瘤重有显著性差异（F=787.416,P＜0.001）。应用LSD法进行两两比较,空白对照组与溶剂对照组无显著性差异（P=0.346）;各治疗组与对照组相比疗效均有显著性差异（P＜0.001）;联合用药组疗效优于索拉非尼及顺铂单药组,有显著性差异（P=0.003和P＜0.001）。治疗后第21天各组瘤重差异有显著性（F=149.748,P＜0.001）,两两比较显示,空白对照组和溶剂对照组瘤重无显著性差异（P=0.069）,联合用药组疗效优于索拉非尼及顺铂单药组,差异有显著性（P均＜0.001）。2.肿瘤组织切片免疫组化结果显示,①五组MVD值差异有显著性,与对照组比较,单药顺铂组MVD无差异（P=0.140和P=0.058）:单药索拉非尼组及联合组的MVD均显著减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。②与对照组相比,索拉非尼单药组和联合组可使VEGF表达明显减少,顺铂组VEGF表达无明显减少。结论:索拉非尼及顺铂分别单独应用对HepG2均有抑制增殖作用,低剂量联合具有协同作用。联合用药可明显增加肝癌细胞的凋亡。两药联合的效应机制与多条细胞信号转导通路有关。其中线粒体凋亡通路有重要作用。索拉非尼和顺铂作用于凋亡途径的不同靶点,或协同作用于某些相同的靶点,分别增加了对凋亡相关分子影响的广度和强度,从而增强了联合诱导肝癌细胞凋亡的作用,增强了抗肿瘤效果。同时联合用药影响MAPK通路。在体内的机制还涉及抗血管生成。