论文摘要
背景和目的:横纹肌肉瘤（rhabdomyosarcoma,RMS）是软组织最好发的恶性肿瘤之一,可发生于任何年龄,恶性程度高,危害较大。近年来,随着化疗等方法的应用和改进,RMS的治疗得到了一定程度的改善,但疗效仍不满意。积极探索RMS发生发展的机理,开发新的抗RMS药物对RMS的防治具有重要意义。诺帝（Nordy）是西南医院病理所自行研制的去甲二氢愈创木酸（nordihydroguaiareticacid,NDGA）类化合物,研究发现,Nordy对体内外生长的肺癌细胞A549和多种胶质瘤细胞以及诱发性胶质瘤具有明显的抑制增殖、诱导分化、抑制肿瘤血管生成等多种生物学作用,提示Nordy可能是一种具有应用潜力的新型抗肿瘤药物。进行Nordy对RMS作用的研究,对Nordy的临床应用和RMS的治疗都具有现实意义。趋化因子及其受体在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要而复杂的作用,是肿瘤研究的一个热点。研究表明多种RMS细胞系均有趋化因子受体CXCR4的表达,但对人RMS的CXCR4蛋白表达及其功能了解尚少。本课题就Nordy对RMS的作用,以及RMS中CXCR4蛋白表达和功能进行了研究。材料和方法:研究对象为24例RMS临床标本和PLA-802细胞系（源自腺泡性RMS）。第一部分:用细胞计数法测定IC50和对PLA-802细胞生长曲线的影响、流式细胞术检测对细胞周期、凋亡的影响、光镜和电镜观察瘤细胞形态学和超微结构的变化及免疫细胞化学染色和ELISA检测瘤细胞myosin和VEGF蛋白的表达研究Nordy对PLA-802细胞的影响。第二部分:将PLA-802细胞移植于裸鼠皮下建立移植瘤模型,通过腹腔注射给予Nordy治疗,测量肿瘤大小变化以确定对移植瘤生长曲线的影响;光镜和电镜观察肿瘤形态学和超微结构的影响;免疫组化染色和图像分析检测对瘤细胞myosin蛋白表达和VEGF蛋白表达的影响以及微血管密度（MVD）的影响;观察Nordy在27mg/kg剂量范围内对裸鼠的毒副作用。第三部分:用免疫组织（细胞）化学染色检测RMS病理标本和体内外生长的RMS细胞系PLA-802 CXCR4蛋白表达。第四部分:用MTT法检测CXCR4对PLA-802细胞增殖的影响、用体外随机迁移模型和48孔趋化板检测CXCR4对PLA-802细胞迁移和趋化的作用、用激光共聚焦技术检测CXCR4对PLA-802细胞内Ca2+浓度的影响及免疫细胞化学染色和ELISA实验检测CXCR4对PLA-802细胞VEGF蛋白表达的影响等检测CXCR4功能。结果:（1）体外实验:1)Nordy对PLA-802细胞作用的IC50为69.23μmol/L;2)50～200μmol/L Nordy对PLA-802细胞生长具有明显的抑制作用,且具有浓度-时间依赖性;3)Nordy处理后细胞形态变梭长,核质比降低,核变小,核仁变小;4)Nordy处理24h后电镜见瘤细胞线粒体嵴紊乱、断裂,空化或形成髓鞘样结构;内质网扩张,粗面内质网脱颗粒;72h时细胞呈椭圆形或梭形;线粒体肿胀减轻,空化减少而髓鞘样结构增多;胞质内较易见到含量不等的肌（微）丝;偶见拟似凋亡小体;5)100μmol/L Nordy处理PLA-802细胞后,12、24h细胞周期的G0/G1期分别增加了15.1%和8.7%,而48、72 h时G2/M期分别增加了317.4%和137.2%,与对照组比较,差异具有统计学意义（P＜0.05）;6)100μmol/L Nordy处理PLA-802细胞,12 h后即出现明显的细胞凋亡峰,并随作用时间的延长而增高,与对照组比较差异显著（P＜0.05）;7)Nordy处理后瘤细胞myosin蛋白表达增高,VEGF蛋白表达降低,与对照组相比,差异具有统计学意义（P＜0.05）;（2）体内实验:1)13.5mg/kg及27mg/kg Nordy治疗组移植瘤生长明显受抑制（P＜0.05）,抑瘤率:前者为47.43%,后者为60.02%;2)治疗组未出现明显药物毒副作用;3)治疗组瘤细胞异型性变小,核分裂像减少;血管减少;4)电镜见治疗组瘤细胞胞质内肌（微）丝增多,甚至形成横纹肌肌原纤维;5)免疫组化染色显示治疗组瘤细胞myosin蛋白表达增高,VEGF蛋白表达降低,与对照组比较差异显著（P＜0.05）。（3）RMS CXCR4蛋白表达检测:不同病理组织学类型RMS组织和体内外生长的PLA-802细胞均存在CXCR4蛋白表达,腺泡性RMSCXCR4蛋白表达比胚胎性强（P＜0.05）;（4）RMS细胞CXCR4功能检测:1)10、25ng/ml SDF-1α能明显刺激PLA-802细胞增殖（P＜0.05）,最佳浓度为10ng/ml SDF-1α;2)40ng/ml SDF-1α能增强PLA-802细胞自发运动的能力（P＜0.05）;SDF-1α能够诱导PLA-802细胞发生趋化运动,在10～100 ng/ml的浓度范围内呈剂量依赖关系,达到最大迁移效果的浓度为100ng/ml;CXCR4抗体能够特异抑制SDF-1α诱导的PLA-802细胞迁移,在1到20μg/ml浓度内这种抑制作用呈剂量依赖的关系,20μg/ml浓度几乎完全抑制30ng/ml SDF-1α诱导的趋化作用;4)SDF-1α在25～100ng/ml浓度范围内呈剂量依赖关系引起PLA-802细胞内Ca2+浓度明显升高（P＜0.05）,其规律是加入SDF-1α后细胞内Ca2+浓度上升,至一定高度后再降低,细胞外存在或不存在钙离子的条件下反应均相同;5)SDF-1α激活CXCR4后PLA-802细胞VEGF蛋白表达升高。结论:①Nordy对PLA-802细胞具有抑制生长、促进凋亡、影响细胞周期、诱导分化、抑制VEGF表达减少血管生成作用;②体内外生长的PLA-802细胞和RMS组织存在CXCR4蛋白表达,其中腺泡性RMS表达强;CXCR4具有促进RMS细胞增殖、侵袭和VEGF表达功能。
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