飞蝗几丁质酶基因的功能研究

论文摘要

昆虫几丁质酶是个庞大的家族,不同几丁质酶的生物学功能存在较大差异。通过几丁质酶家族基因的时空表达特性及其在飞蝗发育中的生物学功能研究,筛选出对飞蝗致死性的几丁质酶基因。采用转基因技术培育表达dsRNA的玉米,初步探索基于RNAi的害虫防治方法。主要内容如下：一、飞蝗几丁质酶基因片段的获得及表达特性分析。搜索飞蝗EST数据库,采用生物信息学方法进行序列分析,共获得7条几丁质酶基因片段；以飞蝗每个龄期第4天蝗蝻整虫以及5龄第4天蝗蝻不同组织部位为材料提取RNA并反转录为cDNA,以此为模板研究飞蝗几丁质酶基因的时空表达特性。采用的研究方法为RT-PCR,结果表明7个几丁质酶基因的时空表达存在明显差异,其中LmCht10主要在表皮表达。二、飞蝗几丁质酶基因10 （LmCht10）的序列特征及时空表达。基于上述研究结果,采用简并引物及RACE-PCR等技术对LmCht10的全长序列进行克隆,共获得cDNA序列9815bp,其中开放阅读框8658bp,编码2886个氨基酸,3’非编码区序列为1157bp。2886个氨基酸序列中包含5个几丁质酶催化区与6个几丁质结合区。与己知昆虫Cht10的全序列比对分析,其5’端缺失约600 bp。以5龄每一天的飞蝗cDNA为模板,研究LmCht10在5龄飞蝗的发育变化图谱,结果发现LmCht10在5龄第6天达到表达高峰；对5龄第6天飞蝗不同组织部位LmCht10的表达研究发现,LmCht10在前肠表达最多,其次为表皮、后肠。三、LmCht10的生物学功能研究。进一步对LmCht10进行RNA干扰实验,研究其生物学功能。结果表明：2龄至5龄任一龄期飞蝗若虫注射AsLmCht10后,几丁质酶基因LmCht10被沉默,表达量显著降低；飞蝗发育过程中,表现为蜕皮延迟,新旧表皮无法分离导致死亡；成虫注射dsLmCht10后,雌虫的寿命明显缩短,产卵量下降,部分虫卵发育畸形甚至无法发育。四、RNAi介导的转基因抗虫玉米研究。基于LmCht10在飞蝗发育过程中的重要作用,构建表达dsLmCht10的重组pBI121质粒,通过花粉介导转入玉米植株,进一步开展RNAi介导的转基因抗虫作物研究。结论：飞蝗具有多个几丁质酶基因,它们的时空表达特性存在差异；LmCht10是一个具有5个几丁质酶催化区与6个几丁质结合区、分子量巨大的几丁质酶,其在飞蝗发育过程中具有十分重要的生物学功能,该基因被沉默后飞蝗无法完成蜕皮而导致死亡,将其用于RNAi介导的害虫防治具有潜在的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 飞蝗简介及其防治现状
• 1.2 昆虫体壁结构与蜕皮
• 1.3 几丁质与几丁质酶
• 1.4 RNA干扰及其在昆虫中的应用
• 1.5 研究内容与意义
• 第二章 飞蝗几丁质酶家族基因的鉴定及表达特性分析
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验昆虫
• 2.1.2 试剂与主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 飞蝗几丁质酶基因片段的获得与表达引物设计
• 2.2.2 飞蝗7个几丁质酶基因的时空表达研究
• 2.2.2.1 不同组织部位cDNA模板制备
• 2.2.2.2 不同发育阶段cDNA模板制备
• 2.2.2.3 飞蝗几丁质酶基因的时空表达分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 飞蝗EST数据库搜索结果及序列分析
• 2.3.2 飞蝗7个几丁质酶基因的时空表达
• 2.4 讨论
• 第三章 飞蝗几丁质酶基因LmCht10的特性研究
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 试剂与仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 飞蝗几丁质酶基因LmCht10 cDNA序列的获得
• 3.2.1.1 表皮总RNA的提取及纯化
• 3.2.1.2 RACE cDNA模板的合成
• 3.2.1.3 扩增几丁质酶基因LmCht10 cDNA的引物设计
• 3.2.1.4 几丁质酶基因LmCht10 cDNA的扩增
• 3.2.1.5 目标片段测序
• 3.2.1.6 序列分析
• 3.2.1.7 序列拼接与验证
• 3.2.2 LmCht10结构域分析及聚类树的构建
• 3.2.3 几丁质酶基因LmCht10在5龄飞蝗的时空表达特性
• 3.2.3.1 5龄不同天数飞蝗cDNA模板制备及差异表达分析
• 3.2.3.2 飞蝗5龄第6天不同组织部位cDNA模板制备及差异表达检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 几丁质酶基因LmCht10 cDNA片段的扩增及拼接
• 3.3.2 几丁质酶基因LmCht10的氨基酸序列分析
• 3.3.3 几丁质酶LmCht10的聚类分析
• 3.3.4 几丁质酶基因LmCht10在5龄飞蝗的时空表达特性分析
• 3.4 讨论
• 第四章 飞蝗几丁质酶基因LmCht10的生物学功能研究
• 4.1 材料与试剂
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 试剂与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 LmCht10 dsRNA的体外合成
• 4.2.1.1 LmCht10 dsRNA引物设计
• 4.2.1.2 cDNA模板的合成
• 4.2.1.3 dsRNA的体外合成
• 4.2.2 dsRNA的注射与观察
• 4.2.2.1 同一基因不同位置合成dsRNA的沉默效率检测
• 4.2.2.2 飞蝗不同龄期dsLmCht10-2的干扰研究
• 4.2.3 LmCht10的沉默效率检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 dsRNA引物序列
• 4.3.2 飞蝗几丁质酶基因LmCht10的RNAi
• 4.3.2.1 同一基因不同位置合成dsRNA的沉默效率检测
• 4.3.2.2 飞蝗不同龄期的RNA干扰结果
• 4.4 讨论
• 第五章 RNAi介导的转基因抗虫作物研究
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 供试玉米
• 5.1.2 试剂与仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 重组质粒的构建
• 5.2.1.1 引物设计
• 5.2.1.2 pBI121-dsLmCht10-2构建
• 5.2.2 转基因玉米培育
• 5.2.3 转基因玉米检测
• 5.2.3.1 转基因玉米总DNA提取
• 5.2.3.2 目的片段检测
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 引物序列
• 5.3.2 构建重组质粒
• 5.3.3 第一代转基因玉米的获得
• 5.3.4 转基因玉米检测
• 5.3.4.1 转基因玉米总DNA提取
• 5.3.4.2 目的片段检测
• 5.4 讨论
• 参考文献
• 硕士期间研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式