论文摘要
目的:Wnt途径是一种对控制胚胎发育起重要作用的信号传导途径,而其不恰当地活化参与人类多种肿瘤的发生。多项肿瘤相关研究显示,Wnt5a是一个良好的肿瘤侵袭和预后标志物,令人费解的是,它在不同肿瘤中具有截然不同的表达水平,但确切关系和作用机制不明,特别是它与白血病发生的关系和作用少见报道。我们的前期研究发现Wnt5a在少数髓系白血病病例中表达下调或缺失,用Wnt5a条件培养液处理白血病细胞株K562,可抑制其恶性增值。本研究拟观察Wnt5a表达缺失在白血病中是否是普遍现象,以及初步观察表达缺失的分子机制,进一步证明Wnt5a表达缺失是否与白血病发生有关。该研究首先发现Wnt5a在白血病病例和白血病细胞株中表达缺失,进而探讨了Wnt5a表达下调的原因,为深入认识Wnt5a在白血病发生中的机制打下坚实基础,通过研究有望为白血病诊断提供新的肿瘤标志物和基因治疗靶点。方法:1.应用RT-PCR方法检测27例正常人骨髓标本和10例脐带血CD34+细胞,以及K562、Jurkat、HL-60、U937白血病细胞株中Wnt5a的表达。2.应用RT-PCR方法检测68例白血病患者和35例完全缓解白血病患者骨髓标本中Wnt5a的表达。3.应用甲基化特异性PCR（MSP）法检测正常人、白血病病例及白血病细胞株中Wnt5a基因启动子甲基化的水平。4.用去甲基化试剂Adc处理白血病细胞株后检测Wnt5a的表达水平和Wnt5a基因启动子甲基化的水平。5.用去甲基化试剂Adc处理白血病细胞株4d,并以台盼蓝染色进行活细胞计数和总细胞计数,绘制生长曲线并进行统计学分析。6.流式细胞仪分析去甲基化试剂Adc处理的K562细胞4 d后细胞周期的变化情况,并与对照组细胞进行比较。结果:1.27例正常人骨髓标本中有24例阳性表达Wnt5a,阳性率为88.9%（24/27）,10例CD34+细胞全部表达Wnt5a,白血病细胞株K562、HL-60、U937均不表达Wnt5a,Jurkat细胞弱阳性表达Wnt5a。2.68例白血病患者骨髓标本中有7例Wnt5a阳性表达,阳性率为:10.1%,35例完全缓解白血病患者骨髓标本中有23例阳性表达Wnt5a,阳性率为:65.7%。3.应用甲基化特异性PCR（MSP）检测正常人Wnt5a基因启动子甲基化的水平,发现没有甲基化;3株白血病细胞株中K562、HL-60、U937细胞的Wnt5a基因启动子均发生了甲基化,Jurkat细胞发生了部分甲基化,而白血病完全缓解病例的Wnt5a基因启动子发生去甲基化。4.用去甲基化试剂Adc处理白血病细胞株K562、Jurkat、HL-60、U937后均检测到Wnt5a的表达水平上调,且Wnt5a基因启动子发生去甲基化。5.用去甲基化试剂Adc处理白血病细胞株K562 4d,并以台盼蓝染色进行活细胞计数和总细胞计数,绘制生长曲线并进行统计学分析,生长曲线显示:去甲基化试剂Adc明显抑制K562细胞的增殖,但台盼蓝染色结果显示未影响到细胞的存活率。6.用流式细胞仪分析Adc处理K562细胞4d后的细胞周期变化情况,并与对照组细胞进行比较,发现细胞周期的G2期增高了3倍,表明Adc处理后, K562增殖的细胞周期被阻滞在G2期。结论:1.RT-PCR方法检测发现,Wnt5a在88.9%（24/27）的正常人骨髓中阳性表达,在100%（10/10）的CD34+细胞中阳性表达,在白血病细胞株中表达缺失,在白血病患者骨髓标本中仅有13.2%（9/68）阳性表达,而在完全缓解的白血病患者骨髓标本中阳性表达率升高达到65.7%（23/35）,是白血病患者的5倍。提示Wnt5a表达缺失可能与白血病的发生有关。2.MSP法检测部分白血病病例和4株白血病细胞均发现Wnt5a基因启动子发生甲基化,而正常人和完全缓解的白血病病例Wnt5a基因启动子没有发生甲基化。提示Wnt5a基因启动子发生甲基化是Wnt5a表达缺失的原因之一。3.用去甲基化试剂Adc处理白血病细胞株后,检测发现Wnt5a基因启动子发生去甲基化,Wnt5a表达上调,与对照组相比:细胞生长明显受到抑制,细胞周期G2期明显增高,提示Adc可能将K562细胞周期阻滞在G2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖。以上研究提示,Wnt5a在白血病病例中普遍表达缺失,而在治疗缓解病例中表达恢复,白血病细胞中Wnt5a启动子甲基化致表达沉默是Wnt5a表达缺失的分子机制,Wnt5a在白血病病例中发挥抑癌基因的作用,其表达缺失是白血病发生的机制之一。
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