粘质沙雷氏菌的原生质体诱变及几丁质酶的研究

论文摘要

本文为进一步提高粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）的几丁质酶活力,对本实验室分离并保存的一株粘质沙雷氏菌RZ21菌株,进行原生质体紫外线与NaNO2复合诱变,经过平板几丁质透明圈初筛与摇瓶复筛,筛选出一株高产几丁质酶的诱变株NU2,其所产几丁质酶的活力相比出发菌株提高了2.75倍,并对其产酶的培养基配方及培养条件进行了优化,最后做了几丁质酶的相关性质研究。在诱变实验中,首先分别进行了原生质体紫外线和化学诱变剂NaNO2的单因子诱变,结果表明,原生质体紫外线诱变的效果要好于化学诱变剂的；在复合诱变试验中,菌悬液先经过化学诱变剂NaNO2诱变之后再经原生质体的紫外线诱变的方法具有较好的诱变效果,HC值相比出发菌株CK提高了60.8%,且菌株的遗传稳定性较好。在培养基配方优化试验中,经过单因素试验与正交试验的优化,培养基配方确定为：最佳碳源为7.5g/L玉米粉,最佳氮源为5.0g/L蚕蛹粉,无机盐NaCl浓度为7.5g/L。除了传统碳氮源及无机盐条件的优化外,本研究结合几丁质酶的可诱导性,通过外加几丁质作为诱导剂提高了酶活的诱导效果。结果表明,胶体几丁质由于其颗粒较小,与酶的活性部位接触表面积较大等优点,诱导效果要优于粉末状几丁质,其中5mg/L的胶体几丁质的诱导效果最好；而粉末状150目的几丁质诱导效果略低于粉末状50目的几丁质。在培养条件优化方面,最佳培养条件为：培养温度30℃,初始pH8.0,装液量40mL/250mL,150rpm培养30h。在此最佳培养基配方及最佳培养条件下,粘质沙雷氏菌诱变株NU2所产几丁质酶的活力为410U,为初始培养基的4.23倍。采用25L发酵罐培养粘质沙雷氏菌NU2诱变株,菌悬液依次进行高压细胞破碎、硫酸铵沉淀与透析等方法提纯几丁质酶。用纯酶进行水解胶体几丁质的酶学性质研究,结果表明该诱变株NU2所产的几丁质酶有热稳定性及pH稳定性较好等优点。该酶的最适反应温度为37℃,在4-60℃之间酶活比较稳定。最适反应体系为pH8.0的0.02M磷酸盐缓冲液,酶在pH5.0-9.0之间较为稳定。镁离子对酶活促进较大,而金属离子螯合剂EDTA则抑制酶的活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1. 导言
• 1.1 几丁质酶及其分类
• 1.2 几丁质酶的分布
• 1.2.1 植物几丁质酶
• 1.2.2 动物几丁质酶
• 1.2.3 微生物几丁质酶
• 1.2.3.1 产几丁质酶微生物的类群
• 1.2.3.2 微生物几丁质酶的性质
• 1.3 微生物产几丁质酶的特性
• 1.3.1 多样性
• 1.3.2 诱导性
• 1.3.3 分泌性
• 1.4 微生物几丁质酶的理化性质
• 1.4.1 环境条件对酶活性的影响
• 1.4.2 分子量
• 1.4.3 等电点
• 1.4.4 金属离子的影响
• 1.5 几丁质酶的应用
• 1.5.1 植物几丁质酶的应用
• 1.5.1.1 参与植物抗胁迫反应
• 1.5.1.2 参与发育调控
• 1.5.1.3 其它生理功能
• 1.5.2 微生物几丁质酶的应用
• 1.5.2.1 抑制病原真菌生长,抵抗真菌感染
• 1.5.2.2 水解几丁质,制备壳寡糖
• 1.5.2.3 在抗病基因工程中的应用
• 1.5.2.4 在害虫防治中具有增效作用
• 1.6 粘质沙雷氏菌合成几丁质酶水解几丁质的研究进展
• 1.7 微生物产碱性几丁质酶研究和应用中所面临的问题
• 2. 实验设计
• 第2章 产几丁质酶RZ21菌株的单诱变与复合诱变
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌种
• 2.2.1.2 培养基
• 2.2.2 主要试剂及来源
• 2.2.3 主要仪器设备型号及来源
• 2.2.4 试验方法
• 2.2.4.1 生长曲线及几丁质酶产酶曲线的测定
• 2.2.4.2 菌悬液的制备
• 2.2.4.3 菌体量的测定
• 2.2.4.4 原生质体的紫外线诱变
• 2诱变'>2.2.4.5 NaNO₂诱变
• 2.2.4.6 复合因素诱变
• 2.2.4.7 摇瓶复筛培养
• 2.2.4.8 诱变株的遗传稳定性研究
• 2.2.4.9 胶体几丁质的制备
• 2.2.4.10 几丁质酶活力的测定
• 2.2.4.11 DNS试剂的配制-Ghose法
• 2.2.4.12 DNS标准曲线
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 粘质沙雷氏菌的生长曲线及产酶曲线
• 2.3.2 原生质体紫外线诱变结果
• 2的诱变结果'>2.3.3 NaNO₂的诱变结果
• 2.3.4 复合诱变结果
• 2.3.5 摇瓶复筛结果
• 2.3.6 诱变菌株遗传稳定性的研究
• 2.4 讨论与分析
• 第3章 产几丁质酶NU2诱变株的培养条件优化
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.1.1 出发菌株
• 3.2.1.2 培养基
• 3.2.2 主要试剂及来源
• 3.2.3 主要仪器设备型号及来源
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 培养方法
• 3.2.4.2 测定方法
• 3.2.4.3 试验方法
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 碳源筛选结果
• 3.3.2 氮源筛选结果
• 3.3.3 无机盐NaCl浓度的筛选
• 3.3.4 外加几丁质形态对酶活提高效果的影响
• 3.3.4.1 胶体几丁质对几丁质酶活力的提高效果
• 3.3.4.2 50目粉末几丁质对几丁质酶活力的提高效果
• 3.3.4.3 150目粉末几丁质对几丁质酶活力的提高效果
• 3.3.5 培养温度对诱变株NU2几丁质酶活力的影响
• 3.3.6 初始pH对诱变株NU2几丁质酶活力的影响
• 3.3.7 转速对诱变株NU2几丁质酶活力的影响
• 3.3.8 装液量对诱变株NU2几丁质酶活力的影响
• 3.3.9 接种量对诱变株NU2几丁质酶活力的影响
• 3.3.10 正交试验
• 3.4 讨论与分析
• 第4章 NU2诱变株几丁质酶酶学性质研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 菌种
• 4.2.1.2 培养基
• 4.2.2 主要试剂及来源
• 4.2.3 主要仪器设备型号及来源
• 4.2.4 实验方法
• 4.2.4.1 几丁质酶的分离纯化
• 4.2.4.2 试剂配制
• 4.2.4.3 蛋白浓度测定方法
• 4.2.4.4 几丁质酶水解活性的测定方法
• 4.2.4.5 温度对几丁质酶活力的影响
• 4.2.4.6 pH对几丁质酶活力的影响
• 4.2.4.7 不同缓冲液对酶活力的影响
• 4.2.4.8 不同化学物质对几丁质酶活力的影响
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 硫酸铵沉淀
• 4.3.2 透析
• 4.3.3 几丁质酶催化水解几丁质的最适作用温度
• 4.3.4 几丁质酶的热稳定性
• 4.3.5 几丁质酶催化水解几丁质的最适作用pH
• 4.3.6 几丁质酶的pH稳定性
• 4.3.7 不同缓冲液对酶活力的影响
• 4.3.8 金属及非金属离子对几丁质酶活力的影响
• 4.3.8.1 酸根离子对酶活的效应
• 4.3.8.2 正一价金属离子对酶活的效应
• 4.3.8.3 正二价金属离子对酶活的效应
• 4.3.8.4 正三价金属离子对酶活的效应
• 4.3.8.5 重金属离子对酶活的效应
• 4.3.9 EDTA对几丁质酶活力的影响
• 4.3.10 SDS-PAGE分析
• 4.4 讨论与分析
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢