论文摘要
【背景】胃癌细胞发生多药耐药（multidrug resistance,MDR）是导致胃癌患者化疗失败的最主要原因。经过几十年的研究,目前已明确胃癌MDR是一个多因素参与的复杂过程。近年来随着基因组学和蛋白质组学研究手段的飞速发展,新的胃癌耐药相关分子不断得以发现,然而胃癌MDR的分子机制仍未完全阐明。值得思考的是,目前的研究大多热衷于挖掘耐药与亲本/药敏细胞之间差异表达的基因,进而探究其介导耐药的下游分子通路,而忽略了导致诸多基因差异表达的幕后操纵者,即这些耐药相关基因的上游调控网络是研究中的盲点。如果逆向探寻上游的调节分子,找到处于耐药分子网络中的“始作俑者”,将其作为靶点来逆转胃癌MDR,将为胃癌化疗开辟新的道路。microRNA （miRNA）是近年来得以发现的一类广泛存在于动植物体内的非编码小RNA,在转录后水平负性调控基因的表达。据预测,每个miRNA可以调控大约200个基因的表达,存在于人体内的大约1000个miRNAs可调控超过1/3的蛋白编码基因的表达,影响着几乎所有的信号通路。miRNA已被证实广泛参与多种生理病理过程,包括肿瘤的发生和发展。由此,我们推测:miRNA可能是我们要寻找的一类处于胃癌耐药分子网络上游的调节分子,调控众多耐药相关基因的表达,进而影响胃癌细胞的耐药表型。目前为止,miRNA在胃癌MDR中的作用及机制尚未见报道。【目的】探讨miRNA在胃癌MDR中的调节作用及其分子机制,以期更全面的阐明胃癌MDR机制,并为寻找新的耐药逆转策略提供理论依据。【方法】1.通过miRNA芯片检测胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR和其亲本细胞SGC7901的miRNA表达谱,找出差异表达的miRNA;2.利用real-time RT-PCR法对miRNA芯片结果进行验证;3.通过细胞转染,利用miR-15b/miR-16/let-7a特异的前体寡核苷酸分别上调SGC7901/VCR细胞中miR-15b/miR-16/let-7a的表达,miR-15b/miR-16/let-7a特异的反义寡核苷酸抑制物分别下调SGC7901细胞中miR-15b/miR-16/let-7a的表达;4.通过MTT试验检测miR-15b/miR-16/let-7a对胃癌细胞（SGC7901、SGC7901/VCR）体外药物敏感性的影响;5.通过小鼠肾包膜下移植法（SRCA）检测miR-15b/miR-16/let-7a对胃癌细胞（SGC7901/VCR）体内药物敏感性的影响;6.利用生物信息学网站或软件预测miR-15b/miR-16/let-7a可能调控的靶基因;7.利用Western blot、RT-PCR以及荧光素酶报告基因实验验证miR-15b/miR-16/let-7a调控的靶基因;8.通过AnnexinV/PI染色流式细胞术和caspase-3/7活性试验分析miR-15b/miR-16对胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR的凋亡敏感性的影响;9.借助宿主细胞再活化试验分析let-7a对胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR的DNA损伤修复能力的影响。【结果】1. 12个miRNAs在胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR和其亲本细胞SGC7901中差异表达（>2倍）,在SGC7901/VCR细胞中表达升高的miRNAs为miR-302b和miR-492,表达降低的miRNAs为let-7a、miR-15b、miR-16、miR-17-5p、miR-20a、miR-23b、miR-106a、miR-106b、miR-196a和miR-320。其中一些miRNAs已报道与肿瘤相关,即‘oncomir’,而与胃癌多药耐药的关系未见报道;2. real-time RT-PCR结果显示:miR-15b、miR-16和let-7a的表达在SGC7901/VCR细胞较SGC7901细胞中显著降低,与芯片结果一致;3.体外药物敏感性实验表明,上调miR-15b/miR-16/let-7a的表达,SGC7901/VCR细胞对不同化疗药物的敏感性显著增加,而下调miR-15b/miR-16/let-7a的表达可显著降低SGC7901细胞对不同化疗药物的敏感性;4. SRCA体内药物敏感性实验证实,上调miR-15b/miR-16/let-7a的表达可显著增强SGC7901/VCR细胞体内对顺铂的敏感性;5. miR-15b和miR-16属于同一miRNA家族,具有结构上的同源性,生物信息学预测的众多miR-15b和miR-16的靶基因中包括已明确的耐药相关分子Bcl-2,而let-7a的预测靶基因中包括已明确的耐药相关分子Ras;6.与对照细胞相比,转染miR-15b/miR-16特异前体的SGC7901/VCR细胞的Bcl-2蛋白水平明显降低,而mRNA水平则无显著差异。miR-15b/miR-16通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的Bcl-2 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达,破坏该靶位点可以解除miR-15b/miR-16对荧光素酶表达的抑制效应;7.与对照细胞相比,转染let-7a反义抑制物的SGC7901细胞的H-Ras蛋白水平明显升高,而mRNA水平则无显著差异。let-7a通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的H-Ras 3’UTR的靶位点,抑制荧光素酶表达。8. AnnexinV/PI染色流式细胞术、caspase-3/7活性试验的结果显示:与对照细胞相比,转染miR-15b/miR-16特异前体的SGC7901/VCR细胞对化疗药物诱导的凋亡的敏感性显著增加;9.宿主细胞再活化试验结果表明:与对照细胞相比,转染let-7a特异前体的SGC7901/VCR细胞的DNA损伤修复能力显著降低。【结论】1. miRNA在胃癌多药耐药细胞和其亲本细胞中差异表达,可能参与胃癌多药耐药的发生;2. miR-15b,miR-16参与调节胃癌细胞多药耐药表型,其可能的分子机制是:miR-15b、miR-16负性调控靶基因Bcl-2的表达,从而调节胃癌细胞对于化疗药物诱导的凋亡的敏感性;3. let-7a参与调节胃癌细胞多药耐药表型,其可能的分子机制是:let-7a负性调控靶基因Ras的表达,从而影响胃癌细胞的DNA损伤修复能力。