刺参器官再生的组织学与相关基因研究

论文摘要

器官和组织的形成是发育生物学中没有解决的神秘的问题。一个器官的形成已经证实很难去解剖,部分是因为这个过程非常连续而且复杂,同时也是因为大部分器官是在胚胎期发育,而这些过程是相互联系的,所有的这些使得研究一个特异的过程非常难。器官再生在成年动物当中也可能发生,尽管范围非常有限,包括丢失的器官的再生。一旦此过程发生,这个过程就可能从空间上分离开来,并且这个暂时的发育事件就可以作为器官生成的一个系统模式来研究。成年动物的器官再生的一个最显著的事件就是海参纲成员在吐脏后能够再生出多种器官。刺参能够在吐脏后迅速再生出其身体器官。新的消化道的发育是一个复杂的过程,包括基因表达的改变,从而导致了有关再生的细胞结构,免疫防御,细胞信号转导等方面的改变。我们将刺参作为一个模型系统利用组织学及现代分子生物学技术来研究刺参的再生。本研究以中国山东地区的养殖刺参（Apostichopus japonicus）为研究材料,刺参体长1015cm,通过注射KCl（0.35mol/L）诱导吐脏。采用组织学方法对刺参吐脏和再生进行了观察,结果显示刺参吐脏后便开始再生,吐脏后的第2天可观察到呼吸树主干及分支结构。腹部肠系膜在吐脏后逐渐增厚,第5天可观察到肠上皮与肌肉组织,再生出新生肠管的时间大约为2周。表达序列标签（Expressed Sequence Tag, EST）技术是近年兴起的一种高通量基因筛选和鉴别的有效方法。本研究利用EST技术对刺参的再生肠组织和正常肠组织表达序列进行大规模测序分析,旨在从EST数据中寻找与刺参再生相关的基因,同时也为今后刺参再生功能相关基因的筛选与克隆奠定良好基础。本文用表达序列标签方法,对刺参肠再生过程中的表达基因进行了鉴定。为了研究刺参再生肠组织与正常肠组织当中的差异表达基因,通过定向克隆法,构建了刺参正常肠组织的cDNA文库（NE）和吐脏后第3-5天再生肠组织的cDNA文库（PE）;从每一个文库中取400个阳性克隆从5′末端进行测序,并对EST序列进行分析。首先,从刺参的再生肠组织和正常肠组织提取mRNA,然后反转录成cDNA,将反转录成的双链cDNA与载体连接构建质粒cDNA文库。结果显示从再生肠组织的cDNA文库当中获得了1.5×106个独立的阳性克隆,而从刺参

论文目录

• 第一章 综述一-海参纲动物的吐脏再生
• 1.1 引言
• 1.2 海参的吐脏过程
• 1.2.1 吐脏模式
• 1.2.2 吐脏的机理和功能
• 1.3 消化道的组织学特征
• 1.4 作为内脏再生中心的肠系膜
• 1.5 肠系膜增厚区的细胞起源
• 1.6 体腔上皮细胞的起源
• 1.7 吐脏再生过程中的细胞分裂
• 1.8 再生持续的时间
• 1.9 其他内脏的再生
• 1.9.1 血管系统的再生
• 1.9.2 呼吸树的再生
• 1.9.3 生殖腺的再生
• 1.9.4 居维氏管的再生
• 1.10 变形再生与发育再生
• 1.11 未来研究分析
• 第二章 综述二-海参纲动物的肌肉再生
• 2.1 引言
• 2.2 海参肌肉系统的形态学
• 2.3 纵肌的发育与增长
• 2.4 肌肉再生
• 2.4.1 内脏肌肉的再生
• 2.4.2 纵肌的再生
• 2.5 肌细胞的来源与细胞迁移
• 2.6 细胞增殖
• 2.6.1 DNA合成活性
• 2.6.2 有丝分裂活性
• 2.6.3 DNA量的变化
• 2.7 海参纲动物肌肉再生的细胞机理
• 2.8 棘皮动物肌肉的进化
• 第三章 刺参吐脏再生的组织学研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 溶液的配制方法
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与分析
• 3.3 讨论
• 第四章 刺参再生肠组织与正常肠组织CDNA文库的构建及EST分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 刺参再生肠组织与正常肠组织总RNA的提取与测定
• 4.1.2 MRNA的分离纯化
• 4.1.3 CDNA的合成与重组
• 4.1.4 重组质粒的测序PCR
• 4.1.5 EST的剪辑与聚类鉴定独立转录本
• 4.1.6 BLASTX搜索：EST同源性对比，基因鉴定和分类
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 总RNA的提取
• 4.2.2 MRNA纯化结果
• 4.2.3 CDNA的合成结果
• 4.2.4 CDNA与载体的连接效率检测结果
• 4.2.5 质粒插入效率和片段长度的检测结果
• 4.2.6 文库的滴度结果
• 4.2.7 EST序列质量结果
• 4.2.8 PE文库和NE文库的独立转录本与聚类分析结果
• 4.2.9 PE文库和NE文库独立转录本的功能与分类
• 4.2.10 PE文库和NE文库高丰度表达的差异基因
• 4.3 讨论
• 第五章 刺参室管膜蛋白基因的克隆、分析与表达研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 刺参EPENAJ基因全长CDNA的获得
• 5.2.2 刺参EPENAJ基因的核苷酸序列特征
• 5.2.3 刺参EPENAJ蛋白的SMART分析
• 5.2.4 刺参EPENAJ蛋白结构预测
• 5.2.5 刺参EPENAJ蛋白功能域及基序的查找
• 5.2.6 刺参EPENAJ蛋白的进化关系
• 5.2.7 RT-PCR检测刺参EPENAJ蛋白基因的表达分析
• 5.3 讨论
• 第六章 刺参枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因克隆、分析与表达研究
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 刺参SUBTILISINAJ基因的克隆与分析
• 6.2.2 刺参SUBTILISINAJ基因的核苷酸序列特征
• 6.2.3 刺参SUBTILISINAJ的氨基酸序列分析
• 6.2.4 刺参SUBTILISINAJ的功能域及基序的查找
• 6.2.5 刺参SUBTILISINAJ的空间结构模拟
• 6.2.6 刺参SUBTILISINAJ成熟肽氨基酸组成与疏水性分析
• 6.2.7 刺参SUBTILISINAJ的表达分析
• 6.3 讨论
• 第七章 刺参C型凝集素基因的克隆与表达研究
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.1.3 刺参C型凝集素全长序列一级结构与二级结构分析
• 7.1.4 刺参再生过程中C型凝集素的表达
• 7.2 结果
• 7.2.1 刺参C型凝集素全长序列的克隆
• 7.2.2 刺参C型凝集素全长序列的特征分析
• 7.2.3 刺参C型凝集素氨基酸序列分析
• 7.2.4 刺参C型凝集素功能域及基序的查找
• 7.2.5 刺参C型凝集素的空间结构模拟
• 7.2.6 刺参C型凝集素成熟肽的氨基酸组成分析
• 7.2.7 刺参C型凝集素的表达分析
• 7.3 讨论
• 第八章 结论
• 参考文献
• 博士期间发表文章
• 致谢