论文摘要
黄芪作为一种常用中药,广泛应用于复方制剂中。为了黄芪资源的可持续利用,本文利用组织培养手段研究了影响膜荚黄芪不定根生长的因素,结果发现不定根在B5培养基中加入30 g/L白糖和2 mg/L IBA的条件下生长良好;生物反应器培养过程中,在5L气升式反应器中（3L培养基）接入鲜物重30 g,长约2 cm的不定根,注入0.10 vvm空气时,可获得大量的不定根。有效成分分析结果表明,膜荚黄芪不定根中多糖含量明显高于栽培膜荚黄芪,总皂苷和黄酮含量与三年生栽培膜荚黄芪无显著差异,但是显著高于一年生栽培膜荚黄芪。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammoma-lyase,PAL,EC4.3.1.5）是植物苯丙烷次生代谢途径的第一个关键酶和限速酶,包括类黄酮在内的一切含苯丙烷骨架的物质都是由该代谢途径直接或间接生成。PAL作为初级代谢和苯丙烷次生代谢的纽带,不仅对于植物的生理代谢和抗逆性有很重要的作用,对医药、生物化工领域也具有重大的现实意义与应用价值。本文利用已知的PAL基因不同植物的氨基酸序列比较分析得保守序列,设计出简并引物,应用RT-PCR和RACE技术,首次成功地从膜荚黄芪中克隆出了PAL基因,命名为AmPAL,并在Genebank登录（EF567076）。AmPAL全长为2650 bp,含有一个完整的2154 bp开放读码框。生物信息学分析表明,AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一个新成员,推测其编码718个氨基酸的多肽,分子量为78.05 KDa,等电点为5.96,与豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且核酸和氨基酸序列相似性都大于80%。Southern杂交分析表明,AmPAL在膜荚黄芪基因组中是一个单拷贝基因。为了了解和鉴定膜荚黄芪PAL基因的功能及生物学活性,用基因重组技术构建了pQE30-AmPAL原核表达载体,继而转入大肠杆菌M15表达6×His融合蛋白。结果表明重组蛋白进行了大量表达,通过Ni-NTA琼脂柱纯化,分子量为78 KDa左右,每克细胞（干物重）纯化出45 mg 6×His-AmPAL。酶活性测定表明,携带6个组氨酸的重组蛋白并不影响蛋白质的功能,可保持AmPAL原有的生物活性,AmPAL比活性为6500 U/mg蛋白质,对L-本丙氨酸的米氏常数Km值为3.35×10-4mM/L。在此基础上,构建了植物表达载体pBI121-AmPAL,并通过农杆菌介导法转化到模式植物拟南芥中,经过分子鉴定证明基因已整合到基因组DNA分子中并在转录水平上进行了表达,酶活性测定结果表明转基因植株活性远远高于未转基因拟南芥植株。本研究最终为AmPAL基因转化到其它药用植物,提高转基因植物中苯丙烷代谢途径次生代谢物含量的研究奠定了基础。