麦长管蚜等六种昆虫OBP3的基因克隆、蛋白表达及麦长管蚜嗅觉相关蛋白鉴定

论文摘要

在农业害虫及其天敌寄主寻找和定位行为过程中,嗅觉起重要作用。在蚜虫及其天敌嗅觉分子机制研究领域,蚜虫报警激素E-β-法呢烯（EβF）是重要研究对象。已有报道豌豆蚜的气味结合蛋白ApisOBP3对EβF具有特异的亲和能力,因此OBP3被认为是蚜虫感知EβF的气味结合蛋白。OBP3在蚜虫中十分保守,也说明该蛋白在蚜虫的嗅觉感受过程中具有十分重要的生理功能。开展多种蚜虫及其天敌等昆虫的EβF感受机制的研究,对了解报警信息素驱避蚜虫和吸引天敌的作用机理、开发基于EβF的“推-拉技术”的害虫综合治理策略具有重要的理论与应用价值。本研究以EβF嗅觉感受为重点,选取具有不同EβF嗅觉行为反应的6种昆虫麦长管蚜、甘蓝蚜、枫长镰管蚜、异色瓢虫、黑带食蚜蝇、长尾管蚜蝇等为实验对象,利用ApisOBP3的cDNA序列设计引物,检测麦长管蚜等6种昆虫体内OBP3基因表达情况;并构建OBP3重组蛋白表达载体,进行蛋白表达;测定枫长镰管蚜对EβF嗅觉行为反应;对麦长管蚜头部进行蛋白组学研究,鉴定其嗅觉相关蛋白。取得的主要结果如下:1.通过基因克隆、蛋白表达等技术手段及后续的配体结合实验,证明能够识别和结合EβF的OBP3在6个实验对象体内均有表达,为上述昆虫对EβF的识别提供了分子生物学依据。麦长管蚜利用EβF作为报警信息素,雌性黑带食蚜蝇及异色瓢虫成虫利用EβF作为利它素;而OBP3在其他实验对象中的表达则说明,EβF可能具有其他生理功能,甘蓝蚜对EβF不敏感,但其机体内存在识别EβF的机制,可能利用EβF的有无来区分同类和寄主植物;枫长镰管蚜不分泌EβF,但具有种内报警信息素;枫长镰管蚜对于外源EβF的回避可能与迁飞过程中寄主识别及更有效地逃避被捕食等有关;雄性黑带食蚜蝇及长尾管蚜蝇可能通过EβF（来自于植物或蚜虫）判断蜜源,雄性黑带食蚜蝇对EβF的趋性可以提高其遇见雌蝇并交尾的几率。本研究在mRNA水平上鉴定与EβF具有亲和能力的OBP3在研究对象中均有表达。为EβF在寄主植物-蚜虫-天敌的化学通讯中发挥重要作用提供了分子生物学依据。2. OBP蛋白家族物种间的系统发育关系显示其符合生灭模型（birth-and-death model）,本研究在枫长镰管蚜体内获得2个仅存在5个氨基酸序列的差异的OBP3蛋白,为OBP蛋白家族起源说即昆虫气味结合蛋白家族起源于串联基因倍增及基因突变提供了典型的实例。3.本研究涉及6个实验对象,分别来自于半翅目、双翅目和鞘翅目。所有实验对象OBP3序列一致性>95%。依据生灭模型推断,OBP3的出现早于昆虫纲向不同目的分散进化。4.本研究发现,黑带食蚜蝇雌性与雄性成虫之间的OBP3表达在序列上存在一个氨基酸的差异。5.通过基于2D电泳技术的蛋白组学研究,在麦长管蚜体内鉴定10个嗅觉等感觉生理过程相关蛋白包括:Save Tol-1、Save Tol-2、Save Tol-3、Save Tol-4、Saor49a、Saor5、Saor5′、Saor7、Saveobp2b、Sagr28b等。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 昆虫气味结合蛋白研究进展
• 1.1.1 OBPs 的配体结合能力
• 1.1.2 OBPs 的立体结构（3D structure）
• 1.1.3 OBPs 的生理功能
• 1.1.4 其他
• 1.1.5 应用研究展望
• 1.2 EβF 在寄主植物-蚜虫-天敌三级营养水平的化学通讯中的作用
• 1.2.1 蚜虫报警信息素EβF
• 1.2.2 植物次生代谢物质EβF
• 1.2.3 蚜虫天敌利他素EβF
• 1.2.4 EβF 在寄主植物-蚜虫-天敌三级营养关系中的作用
• 1.3 本研究的立题依据及目的与意义
• 1.3.1 麦长管蚜是重要的小麦害虫
• 1.3.2 EβF 是麦长管蚜报警信息素的唯一成分
• 1.3.3 与EβF 具有特异结合活性的气味结合蛋白ApisOBP3
• 1.3.4 EβF 在寄主植物-蚜虫-天敌三级营养关系的化学通信中发挥着重要作用
• 1.3.5 麦长管蚜嗅觉信号传递分子机制研究亟待突破
• 1.3.6 本研究创新点
• 第二章 类ApisOBP3 蛋白的cDNA 克隆及序列分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 供试昆虫
• 2.1.2 试剂及仪器
• 2.1.3 RNA 提取
• 2.1.4 cDNA 第一链的合成
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 目的序列的PCR 扩增
• 2.1.7 PCR 产物电泳凝胶回收纯化
• 2.1.8 PCR 产物回收纯化
• 2.1.9 平末端PCR 产物加“A”
• 2.1.10 连接反应
• 2.1.11 大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备
• 2.1.12 转化DH5α
• 2.1.13 质粒提取
• 2.1.14 阳性克隆鉴定
• 2.1.15 序列测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 OBP3 蛋白基因片段的克隆
• 2.2.2 OBP3 蛋白全长基因的克隆
• 2.2.3 序列分析与蛋白的比较建模
• 2.3 小结与讨论
• 第三章 三种蚜虫及两种天敌OBP3 原核表达载体的构建和SaveOBP3 的蛋白表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 供试昆虫
• 3.1.2 质粒和菌种
• 3.1.3 试剂及溶液
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 总RNA 提取
• 3.1.6 cDNA 第一链的合成
• 3.1.7 引物
• 3.1.8 目的序列的PCR 扩增
• 3.1.9 PCR 产物回收纯化
• 3.1.10 连接反应
• 3.1.11 转化DH5α
• 3.1.12 质粒提取
• 3.1.13 阳性克隆鉴定
• 3.1.14 序列测定
• 3.1.15 酶切克隆载体获得目的序列
• 3.1.16 目的序列与表达载体的连接反应
• 3.1.17 转化M15 细胞
• 3.1.18 诱导表达
• 3.1.19 OBP3 重组蛋白的纯化及复性
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 表达载体的构建
• 3.2.2 麦长管蚜重组OBP3 蛋白的表达与纯化
• 3.2.3 重组蛋白与EβF 的亲和能力测定
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 枫长镰管蚜的嗅觉行为反应测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 供试昆虫
• 4.1.2 EβF 溶液
• 4.1.3 四臂嗅觉仪
• 4.1.4 实验设计
• 4.1.5 数据转换和统计分析
• 4.2 结果与分析
• 4.3 小结与讨论
• 第五章 麦长管蚜头部嗅觉等感觉相关蛋白的鉴定
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 供试昆虫
• 5.1.2 仪器及试剂
• 5.1.3 麦长管蚜头部总蛋白抽提
• 5.1.4 提取蛋白浓度测定
• 5.1.5 IPG 胶条水化
• 5.1.6 第一向等电聚焦电泳（IEF）
• 5.1.7 胶条的平衡
• 5.1.8 第二向SDS-PAGE 电泳
• 5.1.9 凝胶的固定和染色
• 5.1.10 样品胶分析
• 5.1.11 切取分析胶目的蛋白点
• 5.1.12 目的蛋白的消化
• 5.1.13 测序
• 5.1.14 序列比对
• 5.2 结果与分析
• 5.3 小结与讨论
• 第六章 全文结论
• 6.1 在 mRNA 水平上证实 EβF 在寄主植物-蚜虫-天敌的化学通讯中，是一个重要的化学信息物质
• 6.2 枫长镰管蚜DplaOBP3 表达情况支持Zhou 等昆虫气味结合蛋白家族起源说
• 6.3 OBP3 基因的出现早于昆虫纲向不同目的分散进化
• 6.4 黑带食蚜蝇的OBP3 表达存在性二型性
• 6.5 从麦长管蚜头部鉴定嗅觉等感觉相关蛋白的表达
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历