论文摘要
背景与目的特发性血小板减少性紫癜（ITP）是儿童最常见的由于血小板破坏过多的出血性自身免疫性疾病，本病的发病机制尚未完全阐明，临床上按其病程是否超过6个月将其分为急性型（AITP）和慢性型（CITP）。研究发现，一些免疫细胞、细胞因子参与到ITP的发病发展过程中。正常的机体免疫反应有一个精密、严格的调控系统，若该调控系统发生紊乱，使自身免疫的发生、持续与强度失控，并最终导致自身免疫病。最近在诱导自身抗体产生的小鼠模型中发现，被动输入CD4+CD25+Treg细胞能够减少或完全抑制自身抗体的产生。新近的研究表明，CD4+CD25+Treg可通过产生抑制性细胞因子，如IL-10、TGF-β等；依赖CTLA-4等共刺激分子，通过细胞—细胞接触依赖的抑制模式发挥作用，最终通过抑制Th细胞的活化和分化、直接抑制B细胞活化产生抗体两种途径来阻止自身免疫病的发生。NK细胞是一类无T和B细胞特征性表面标志的淋巴细胞，也是一类重要的免疫调节细胞，表面标志主要有CD16、CD56等，其免疫调节作用主要通过分泌IFN-γ和TNF-β、GM-CSF等细胞因子实现。研究发现，ITP患儿外周血中NK细胞的活性降低、与CD4+／CD8+比值呈正相关，与病情严重程度密切相关。本实验目的是通过研究CD4+CD25+Treg细胞和NK（CD16+，CD56+，CD16+，CD56+）细胞在儿童特发性血小板减少性紫癜发病中的表达情况，进一步探讨ITP的发病机制，并为治疗ITP提供理论依据。材料与方法1．实验对象：24例AITP和21例CITP，均于此次治疗前抽取外周血2ml，以EDTA抗凝，对照组为15例排除血液系统疾病的儿童。2．检测指标：①染色：ITP患儿及正常对照组儿童以EDTA抗凝的新鲜外周血2ml，每个试管中加入抗体10μl，加抗凝全血50μl混匀。避光20～30分钟。②溶血：每个试管再复加溶血素1μl，混匀，避光15分钟后，以1000～1500转／分离心5分钟，弃上清。③洗涤：在上述剩余液中加PBS液1ml，混匀，离心（同上），弃上清。④上机待检：在上述剩余液中加0.5ml PBS液，上机待检。每个样本获取6000个细胞，用流式细胞仪CELLQUGST软件检测其中CD4+，CD25+，CD16+，CD56+的表达率。3．数据处理：用统计学分析软件包SPSS11.0进行统计学分析，实验数据用均数±标准差（（?）±s，％）表示，以α=0.05为检验水准。采用方差分析及直线相关分析。结果1．外周血CD4+CD25+Treg细胞（％）比较：AITP患儿组为2.11±0.53，CITP患儿组为1.18±0.47，对照组为7.40±0.26，AITP患儿组和CITP患儿组CD4+CD25+Treg细胞（％）较对照组为低，都有高度显著差异性（p=0.000），AITP患儿组和CITP患儿组之间也有高度显著差异（p=0.008），AITP患儿组较CITP患儿组为高。2．外周血CD4+T细胞（％）比较：AITP患儿组为22.95±7.34，CITP患儿组为21.53±5.59，对照组为36.84±6.49，AITP患儿组外周血CD4+T细胞（％）低于对照组（p=0.009），CITP患儿组外周血CD4+T细胞（％）低于对照组（p=0.008），但AITP、CITP组之间没有显著差异（p=0.832）。3．外周血NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）比较：AITP患儿组为8.55±1.68，CITP患儿组为7.30±1.47，对照组为14.22±2.41，AITP患儿组外周血NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）低于对照组（p=0.005），CITP患儿组外周血CD4+T细胞（％）低于对照组（p=0.004），但AITP、CITP组之间没有显著差异（p=0.802）。4．外周血CD4+CD25+Treg细胞（％）与NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）相关性分析：AITP患儿组CD4+CD25+Treg细胞（％）与NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）呈正相关性（r=0.43），CITP患儿组CD4+CD25+Treg细胞（％）与NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）无相关性（r=0），对照组CD4+CD25+Treg细胞（％）与NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）呈正相关性（r=0.26），但相关性很小。5．外周血CD4+CD25+Treg细胞（％）、NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）与血小板数量的相关性分析：其中AITP外周血CD4+CD25+Treg细胞（％）与血小板数量的相关性最大（r=0.37），AITP组中NK（CD16+，CD56+，CD16+CD56+）细胞（％）与血小板数量相关性较小（r=0.26），CITP以及对照组中此二指标与血小板数量均无相关性（r=0）。结论1．CD4+CD25+Treg和NK细胞降低，其抑制Th细胞和B细胞的功能减退，致使Th细胞和B淋巴细胞过度活化，机体细胞免疫和体液免疫紊乱，最终导致ITP的发生。2．CITP组与AITP组相比，CD4<sup>CD25+Treg降低更明显，提示细胞免疫在CITP中作用显著。