鳙鱼性别特异片段的筛选和克隆

论文摘要

关于动物性别的研究一直深受人们的关注,以哺乳动物为代表已取得了许多可喜的成果。鱼类在脊椎动物进化系统中处于处于承前启后的地位,具有很丰富的生物学特征以及重大的经济价值,是在脊椎动物中种类最多,分布又最广的类群,因此,对鱼类性别决定机制的研究具有重要的意义。目前已经发现的鱼类的性染色体类型只占很小的比例,其性染色体和常染色体很难进行区分在外形上,是因为鱼类的性染色体处于动物染色体进化的原始状态。利用传统的细胞遗传学技术很难检测到在鱼类中雌雄个体基因组水平上的差异,但是随着生物分子学技术的快速发展,把分子标记技术应用于寻找鱼类性别特异片段的成功事例不断出现,为鉴定鱼类的遗传性别奠定了基础。本研究以鳙鱼为实验材料,利用RAPD指纹分析和ISSR扫描及Southern杂交技术对其开展了一系列分子细胞遗传学研究。鳙鱼[Aristichthys nobilis （Richardson）]属于鲤形目,鲤科,鲢亚科,鳙属。我国各大水系均有此鱼,分布于亚洲东部,以长江流域中、下游地区为主要产地。我国淡水养殖业中的“四大家鱼”之一,是我国重要经济鱼类,在我国鲤科鱼类中具有很重要的经济价值。本研究是首次利用分子标记寻找鳙鱼的性别特异片段。本研究利用采自河南省水产研究院詹店养殖基地的鳙鱼为材料,选择420条长10bp的随机引物和77条ISSR引物分别对鳙鱼不同性别的DNA池和不同个体的基因组DNA进行RAPD指纹分析和ISSR扫描。结果发现在随机引物S1269和ISSR引物ISSR-65扩增中雌性个体都出现了一条特异片段,经克隆和碱基测序后,发现该片段长600bp和754bp。根据该片段碱基序列分别设计一对特异引物,以雌雄个体基因组DNA为模板进行PCR扩增,管家基因β-actin作为阳性对照。结果发现,随机引物S1269在雌雄个体中都有,只有ISSR引物ISSR-65在雌性个体中出现特异扩增产物。利用地高辛对该片段进行标记作为探针,斑点杂交和Southern杂交显示,阳性信号出现于雌性个体中,而在雄性个体中没有发现任何杂交信号。BLAST检索比对,结果没有发现任何与其同源的序列。以上结果表明,我们成功的分离到了鳙鱼的雌性特异片段,为探讨鱼类的性别决定机制以及鱼类遗传性别的识别奠定了理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 动物的性别决定与性别分化
• 1.1.1 动物的性别决定类型
• 1.1.2 动物性别决定与性别分化的分子机制
• 1.2 鱼类的性别决定与性别分化
• 1.2.1 鱼类的性别决定类型
• 1.2.2 鱼类性别决定相关基因
• 1.3 鱼类重复序列的研究
• 1.3.1 重复序列的类型和特点
• 1.3.2 重复序列在鱼类基因组中的研究
• 1.4 鉴别鱼类性别决定的DNA 分子标记
• 1.4.1 DNA 分子标记的种类和特点
• 1.4.2 DNA 分子标记在寻找鱼类性别决定基因过程中的应用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 分子克隆所用载体及宿主菌
• 2.1.3 随机引物，ISSR 引物
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 本研究常用溶液配方
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 基因组DNA 的制备
• 2.2.2 PCR 扩增
• 2.2.3 扩增产物的回收
• 2.2.4 回收片段的克隆
• 2.2.5 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.2.6 序列测定、分析
• 2.2.7 性别特异DNA 片段的PCR 验证
• 2.2.8 制备并检测探针
• 2.2.9 杂交验证
• 3 结果
• 3.1 鳙鱼基因组DNA 的提取
• 3.2 RAPD 结果与分析
• 3.3 ISSR 结果与分析
• 3.3.1 性别特异DNA 候选片段的筛选和克隆
• 3.3.2 性别特异DNA 片段的PCR 和Southern 杂交验证
• 3.3.3 基因组DNA 的斑点杂交
• 4 讨论
• 4.1 利用RAPD 技术寻找鳙鱼的性别决定基因
• 4.2 利用ISSR 技术寻找鳙鱼的性别决定基因
• 4.3 水产养殖单性鱼的培育
• 4.4 后续工作思路
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果