小菜蛾颗粒体病毒抗凋亡基因iap的功能研究

论文摘要

小菜蛾是发生在十字花科蔬菜上最具破坏性的世界性害虫之一,发生代数多,极易对化学农药产生抗性。小菜蛾颗粒体病毒（Plutella xylostella granulovirus, PlxyGV）是小菜蛾的天然控制因子。其基因组全序列己于2000年发表。IAPs （inhibitor of apoptosis）是一类抑制细胞凋亡蛋白家族的总称。它们在结构上都含有BIR. RING结构域。杆状病毒感染常会引起宿主细胞的免疫反应,使细胞凋亡。抑制细胞凋亡可以延长细胞的存活时间,从而可以维持病毒的复制增殖和传播。根据PlxyGV基因组序列分析,PlxyGV中含有一个iap同源基因（nt80675-81520）。序列比对分析显示,PlxyGV iap基因预期编码产物与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus, AcMNPV）IAPs以及苹果小卷叶蛾颗粒体病毒（Cydia pomonella granulovirus, CpGV）IAP3序列相似度较高。功能互补性试验己证实CpGV IAP3具有抗细胞凋亡的功能,而PlxyGV IAP的功能未知。本研究采用瞬时表达的方法研究PlxyGV IAP的功能。首先,用PlxyGV iap瞬时表达质粒转染草地贪夜蛾细胞系（Spodoptera frugiperda,Sf9）;再在培养液中加入放线菌酮D或接种AcMNPV p35缺失突变体（AcMNPV△P35）感染液；通过光镜观察,流式细胞仪检测和DNA梯度电泳图谱等方法检测细胞的凋亡情况。实验结果显示,在接种AcMNPV△P35的情况下,被PlxyGV iap转染的Sf9细胞的凋亡率显著低于未被PlxyGV iap转染的细胞；在用放线菌酮D处理的情况下,被PlxyGV iap转染的Sf9细胞的凋亡率与未被PlxyGV iap转染的细胞相比无显著差异。由此推断,在Sf9细胞中PlxyGV IAP可以有效地抑制由AcMNPV△P35诱导的细胞凋亡；而不能有效抑制放线菌酮D诱导的细胞凋亡。为了进一步确定PlxyGV IAP抑制细胞凋亡作用的功能域,用PCR方法对PlxyGV iap基因做渐进截短突变,将截短突变体用于对AcMNPV△P35诱导的细胞凋亡抑制实验。实验结果显示,PlxyGV IAP的BIR结构域或RING结构域的破坏,都会导致IAP抗细胞凋亡功能的丧失。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文章中的缩略词
• 一、前言
• 1.1 细胞凋亡
• 1.1.1 细胞凋亡概念的提出
• 1.1.2 细胞凋亡的意义
• 1.1.3 凋亡通路的保守性及研究进展
• 1.2 IAP
• 1.2.1 杆状病毒与宿主细胞凋亡
• 1.2.2 杆状病毒IAP抗凋亡作用研究进展
• 1.2.3 不同生物类群的IAPs
• 1.3 本研究的目的和意义
• 二、材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 工具酶,化学试剂和试剂盒
• 2.1.2 实验中常用的储存液
• 2.1.3 实验中常用的缓冲液
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 实验仪器设备
• 2.1.6 昆虫细胞系
• 2.1.7 大肠杆菌菌株
• 2.1.8 质粒
• 2.1.9 病毒
• 2.1.10 用于iap截短突变的引物（表一）
• 2.2 方法和步骤
• 2.2.1 表达载体的构建
• 2.2.2 质粒DNA转染
• ΔP35的空斑测定'>2.2.3 AcMNPV^ΔP35的空斑测定
• ΔP35对培养细胞的感染'>2.2.4 AcMNPV^ΔP35对培养细胞的感染
• 2.2.5 细胞DNA的提取与电泳分析
• 2.2.6 PI单染法检测细胞凋亡
• 2.2.7 Trypan blue染色计数死细胞
• 三、实验结果与分析
• 3.1 PlxyGV IAP与其它杆状病毒IAP序列比对分析
• 3.2 PlxyGV IAP在Sf9细胞中的瞬时表达
• 3.3 PlxyGV IAP抑制由病毒感染诱导的细胞凋亡
• 3.4 PlxyGV iap截短突变体的瞬时表达质粒的构建
• 3.5 N-末端截短对IAP抗凋亡功能的影响
• 3.6 C-端截短对IAP抗凋亡功能的影响
• 3.7 内部截短对IAP抗凋亡功能的影响
• 四、讨论
• 4.1 根据实验结果推测PlxyGV IAP抑制细胞凋亡的通路
• 4.2 PlxyGV IAP蛋白抑制细胞凋亡作用的功能域分析
• 4.3 PlxyGV IAP的BIR、RING两个结构域在抑制细胞凋亡作用中的关系
• 参考文献
• 致谢