改性聚（D，L-乳酸）与MC3T3-E1细胞的生物相容性

论文摘要

聚乳酸材料是具有良好生物相容性的合成生物可降解材料。采用马来酸酐和丁二胺依次对聚（DL-乳酸）（DLPLA）进行化学改性,以提高材料的亲水性,消除或减弱聚乳酸降解产物的酸性,促进材料与细胞之间的粘附,从而提高材料的生物相容性。在合成此类改性材料的基础上,本文采用体外细胞培养法,以MC3T3-E1为模型细胞,将细胞与各基质材料复合培养,从细胞形态学、细胞附着与铺展、细胞增殖与细胞周期、细胞生理功能以及I型胶原和OPN表达等方面考查细胞在丁二胺改性聚乳酸（DPLA）、马来酸酐改性聚乳酸（MPLA）和DLPLA上的细胞行为,综合评价DPLA、MPLA和DLPLA与MC3T3-E1的生物相容性,为进一步的动物体内实验和临床应用提供理论依据主要工作和结论如下:（1）材料的合成及其性能评价:将聚乳酸（DLPLA）沿马来酸酐改性——脂肪族二胺改性的路线依次进行整体修饰,从而制备出新型仿生聚乳酸基质材料。其中,马来酸酐的引入主要是给材料提供高反应活性的酸酐键;二胺的引入主要是为了克服聚乳酸材料降解产物呈酸性的缺陷。采用罗丹明比色法、茚三酮显色法和氨基酸分析仪检测法对产物中的马来酸酐、二胺进行定量测定。采用静态水接触角和吸水率对材料的亲/疏水性能进行评价（2）细胞培养:采用体外细胞培养法培养前成骨细胞系MC3T3-E1细胞;MC3T3-E1细胞常用于骨组织工程支架的生物相容性评价[1],是目前被广泛用于研究材料骨诱导能力的细胞系之一,可以用于材料上细胞相容性比较的实验研究。（3）细胞在基底材料上的黏附和铺展:相差显微镜观察细胞与基底材料复合培养4h,8h,24h的生长情况,并拍照记录。采用HE染色技术观察MC3T3-E1细胞与基底材料上复合培养3d后的生长情况,并照相记录。实验结果表明:DPLA组的细胞密度高于MPLA组和DLPLA,而且DPLA组材料基底上的细胞形态呈三角形或短梭形,相对而言,MPLA和DLPLA上生长的细胞密度较小,表明细胞在DPLA上的形态学表现优于在MPLA和DLPLA的。就细胞形态学表现而言, DPLA具有比MPLA和DLPLA更好的细胞相容性。而且不同接枝率的DPLA对细胞形态有影响,接枝率高的改性材料更有利于细胞的铺展;采用微吸管吸吮技术测细胞与基底材料复合培养0.5h和4h后的黏附力大小。实验结果表明:DPLA更有利于细胞的黏附,且高含量的丁二胺改性材料更有利于细胞的黏附与铺展。（4）采用MTT法测定MC3T3-E1细胞接种在基质材料上后第2、4、6、8天的细胞增殖存活能力,绘出生长曲线;通过流式细胞仪对与三种材料复合培养72h后细胞的细胞周期进行分析,发现细胞的增殖能力及生长曲线因培养基底材料不同而不同。细胞在各组材料上都具有增殖能力,其中,在DPLA上的细胞活性显著大于在MPLA和DLPLA上的,MPLA组的要大于在DLPLA上的。DPLA能使进入分裂前期（G2/M）及分裂期（S）的细胞增多,而MPLA、DLPLA对细胞周期的影响较小,表明DPLA促进了细胞的增殖能力,促进细胞的分裂增殖。在促进增值分裂方面,DPLA具有比MPLA和DLPLA更好的细胞相容性。高接枝率的丁二胺改性材料在促进细胞增殖跟分裂方面效果更好。（5）采用BCA法,测定细胞与材料复合培养第5、10、15天后总蛋白质含量,比较三种材料对细胞活性的影响,采用酶动力法测定细胞在基底材料上第7、14、21天的碱性磷酸酶（ALP）活性。通过比色法对基底材料上细胞培养第5、10、15天钙含量进行测定。实验结果表明,培养第5天总蛋白含量DPLA高于其他组,MPLA组大于DLPLA组。培养第10天各组蛋白质含量增加明显;在各时间点,DPLA的碱性磷酸酶强度要高于其他材料组;在培养7天后,DPLA组细胞分泌的无机钙水平高于其他组,DPLA促进了细胞成骨作用这一重要功能活动。以细胞生理功能而论,DPLA要比MPLA和DLPLA具有更好的细胞相容性。（6）采用RT-PCR法检测MC3T3-E1细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达情况。采用Western blot法检测MC3T3-E1细胞Ⅰ型胶原和骨桥素（OPN）的表达情况。结果显示,不同基底材料对细胞的相关基因的表达均能产生不同的影响。综合本研究结果表明,就细胞相容性而言,改性聚乳酸DPLA和MPLA具有比DLPLA更好的细胞相容性,与MPLA和DLPLA相比,DPLA具有最好的细胞相容性,而且接枝率不同对细胞影响也不同,提示含-COOH和-NH2量高的DPLA是一种具有良好生物相容性的生物医学材料。进一步的研究将转入动物体内实验,为DPLA的进一步应用奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.2 本文研究的目的和研究内容
• 1.3 本论文的创新点
• 2 材料合成和性能评价
• 2.1 前言
• 2.2 材料的制备
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.3 材料的表征
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 马来酸酐含量的测定
• 2.3.3 丁二胺含量的测定
• 2.3.4 材料静态接触角的测定
• 2.3.5 材料吸水率的测定
• 2.4 结果与讨论
• 2.5 本章小结
• 3 MC3T3-E1 细胞的培养
• 3.1 前言
• 3.2 MC3T3-E1 细胞的培养
• 3.3 结果与讨论
• 3.4 本章小结
• 4 细胞在基底材料上的形态、黏附及铺展
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料和方法
• 4.2.1 材料薄膜的制作
• 4.2.2 细胞材料复合培养
• 4.2.3 细胞在材料上的形态学观察
• 4.2.4 细胞在材料上的黏附
• 4.2.5 细胞在材料上的铺展
• 4.3 结果与讨论
• 4.4 本章小结
• 5 细胞在基底材料上的增殖和细胞周期
• 5.1 前言
• 5.2 材料和方法
• 5.2.1 合成材料薄膜的制作
• 5.2.2 细胞-材料复合培养
• 5.2.3 细胞增殖检测
• 5.2.4 细胞周期
• 5.3 结果与讨论
• 5.4 本章小结
• 6 细胞在基底材料上生理功能
• 6.1 前言
• 6.2 材料和方法
• 6.2.1 合成材料薄膜的制作
• 6.2.2 细胞-材料复合培养
• 6.2.3 细胞在不同材料上蛋白质含量的测定
• 6.2.4 MC3T3-E1 细胞在不同材料上碱性磷酸酶活性的测定
• 6.2.5 MC3T3-E1 细胞在不同材料上无机钙的测定
• 6.3 结果与讨论
• 6.4 本章小结
• 7 材料对细胞Ⅰ型胶原和OPN 表达的影响
• 7.1 前言
• 7.2 材料和方法
• 7.2.1 主要实验仪器
• 7.2.2 实验试剂
• 7.2.3 材料薄膜的制作
• 7.2.4 细胞和材料复合培养
• 7.2.5 总RNA 提取
• 7.2.6 反转录合成单链cDNA
• 7.2.7 PCR 扩增
• 7.2.8 RT-PCR 产物的分析
• 7.2.9 蛋白质印迹（Western blot）检测
• 7.3 实验结果
• 7.3.1 RT-PCR 扩增条件及其循环数的确定
• 7.3.2 不同基底材料对细胞作用I 型胶原mRNA 表达的影响
• 7.3.3 蛋白质印记I 型胶原和OPN 结果分析
• 7.4 讨论
• 7.5 本章小结
• 8 结论和后续工作建议
• 8.1 结论
• 8.2 后续工作建议
• 致谢
• 参考文献
• 附录