家蚕Wibg基因的表达与定位分析功能的初步研究

论文摘要

我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中筛选得到一条cDNA,经生物信息学分析发现其包含一个小的Mago-bind superfamily保守结构域,命名为Bombyx mori Within bgcn homolog（BmWibg）。BmWibg基因含有一个内含子,cDNA长为853 bp,ORF大小为582 bp,编码193个氨基酸残基,预测分子量为21.86 kD,等电点为9.538。本实验根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物,PCR扩增出目的基因,插入融合表达载体pET-28a（+）,成功构建重组表达质粒,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,菌体诱导后经SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达成功,并通过Ni-NTA柱亲和层析得到纯化的重组蛋白,经质谱鉴定蛋白大小与预测的相符。用该重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测效价在1:25600以上。提取家蚕各时期及组织的RNA,设计特异引物利用RT-PCR检测BmWibg在转录水平上差异。结果表明:在各时期中,基因BmWibg在卵中的转录水平最高,蛾中最低;各组织中BmWibg基因在精巢中的转录水平最高。提取家蚕卵、五龄幼虫、蛹和蛾四个时期及五龄幼虫的头、精巢和丝腺等组织的总蛋白,进行免疫印迹实验,结果显示,BmWibg蛋白在家蚕五龄幼虫、蛹和卵均检测到表达信号,而在蛾中没有检测到BmWibg蛋白,在组织中只检测到丝腺、精巢和头。ELISA半定量结果显示,各时期中蛋白含量亦是卵中最高蛾中最低,各组织中丝腺和精巢中BmWibg含量最高。这三种方法分别从转录水平和表达水平检测BmWibg的分布,其结果基本一致。以家蚕BmN细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,BmWibg蛋白在细胞质中均匀分布。我们推测BmWibg基因是重要的家蚕早期生殖分化相关的基因。这些结果为深入研究家蚕BmWibg基因的功能奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 前言
• 2 Wibg 与bgcn 的关系
• 2.1 bgcn 简介
• 2.2 bgcn 和bam 的关系
• 2.2.1 bam 基因简介
• 2.2.2 bgcn 和bam 基因功能关系相近并剂量敏感
• 2.3 bgcn 跟DExH 盒蛋白的关系
• 3 Wibg 与Mago-bind 超家族的关系
• 4 Wibg 的研究现状及展望
• 第二章 实验设计方案
• 1 实验的目的、意义
• 2 研究内容
• 3 试验流程图
• 第三章 生物信息学分析
• 1 生物信息学分析软件
• 2 方法
• 2.1 BmWibg 基因的获得
• 2.2 BmWibg 基因的序列分析
• 3 结果
• 3.1 BmWibg 的基本信息
• 3.2 BmWibg 蛋白的疏水性分析
• 3.3 BmWibg 蛋白的信号肽分析
• 3.4 BmWibg 蛋白跨膜区预测
• 3.5 BmWibg 蛋白定位的预测
• 3.6 BmWibg 蛋白磷酸化位点预测
• 3.7 BmWibg 蛋白的二级结构预测
• 3.8 BmWibg 蛋白的三级结构预测
• 3.9 BmWibg 氨基酸序列同源性分析
• 3.10 BmWibg 蛋白的进化树构建
• 4 讨论
• 第四章 家蚕Wibg 基因的克隆
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.2.1 培养基
• 1.2.2 抗生素
• 1.2.3 碱裂解法提取质粒DNA 用溶液
• 1.2.4 核酸电泳所用溶液
• 1.2.5 其它溶液
• 2 方法
• 2.1 重组表达质粒的构建策略
• 2.2 质粒提取
• 2.3 PCR 扩增
• 2.3.1 设计引物
• 2.3.2 PCR 反应体系
• 2.3.3 PCR 反应程序
• 2.4 双酶切PCR 产物与pET-28a（+）载体
• 2.5 纯化酶切产物
• 2.6 连接反应
• 2.7 E.coli TG1 感受态细胞的制备
• 2.8 连接产物的转化
• 2.9 重组克隆的筛选与鉴定
• 2.9.1 挑选单菌落
• 2.9.2 质粒的小量制备
• 2.9.3 PCR 鉴定
• 2.9.4 双酶切鉴定
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增结果
• 3.2 重组质粒的双酶切鉴定
• 3.3 序列测定
• 4 讨论
• 第五章 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达、纯化
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 1.3.1 SDS-PAGE 用溶液
• 1.3.2 凝胶过滤用溶液
• 1.3.3 镍柱亲和层析纯化用试剂
• 2 方法
• 2.1 融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.2 SDS-PAGE 电泳分析
• 2.3 融合蛋白的纯化
• 3 结果
• 3.1 融合蛋白的诱导表达及纯化
• 3.2 FPLC 分离纯化
• 3.3 融合蛋白分子量的质谱鉴定
• 4 讨论
• 第六章 多克隆抗体的制备，效价测定及Western blotting
• 1 试剂与材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂
• 1.2.1 抗体制备用试剂
• 1.2.2 ELISA 用溶液
• 1.2.3 Western blotting 用溶液
• 2 方法
• 2.1 抗体制备
• 2.1.1 抗原制备
• 2.1.2 免疫动物
• 2.1.3 多克隆抗血清的制备
• 2.2 抗体的效价测定
• 3 抗体的纯化
• 4 Western blotting 检测抗体的特异性
• 5 结果
• 5.1 抗体的效价测定
• 5.2 抗体的纯化
• 5.3 Western blotting 检测抗体的特异性
• 6 讨论
• 第七章 组织定位
• 1 材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 1.3.1 蛋白提取裂解液
• 1.3.2 Bradford 检测用试剂
• 1.3.3 SDS-PAGE 用溶液
• 1.3.4 Western blotting 用溶液
• 1.3.5 ELISA 用溶液
• 2 方法
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 反转录（RT）反应
• 2.3 荧光定量PCR 引物的设计
• 2.4 荧光定量PCR
• 2.5 荧光定量PCR 数据分析
• 2.6 总蛋白质的提取及定量
• 2.6.1 总蛋白质的提取
• 2.6.2 Bradford 法进行定量
• 2.7 Western blotting 检测BmWibg 蛋白的分布
• 2.8 ELISA 测定蚕蛹总蛋白中BmWibg 的含量
• 3 结果
• 3.1 家蚕发育过程中mRNA 量的变化
• 3.2 五龄幼虫各组织中 mRNA 量的比较
• 3.3 Western blotting 检测家蚕发育过程中BmWibg 蛋白表达量的变化
• 3.4 Western blotting 检测BmWibg 蛋白在各组织中的分布
• 3.5 BmWibg 在家蚕中的含量
• 3.5.1 制作ELISA 标准曲线
• 3.5.2 测定家蚕总蛋白中BmWibg 的含量
• 4 讨论
• 第八章 亚细胞定位试验
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂配制
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢