自体成体干细胞移植治疗兔眼外肌机械性损伤的实验研究

论文摘要

第一章肌卫星细胞的体外分离、原代培养和免疫荧光特性目的:研究眼外肌卫星细胞的体外生长特点;比较其与骨骼肌卫星细胞免疫荧光特性的异同。方法:采用肌块组织酶原消化法体外分离并原代培养眼外肌卫星细胞和骨骼肌卫星细胞,光镜下动态观察两种细胞的生长变化。免疫荧光法检测肌管及新生纤维标记物（新生型肌球蛋白重链）、肌源性标记物（结蛋白、肌生成素）、肌纤维母细胞标记物（α-平滑肌肌动蛋白）、肌细胞标记物（肌球蛋白轻链）、眼外肌特异性肌球蛋白等5类6种抗体在细胞的染色情况,比较两种细胞免疫荧光特性的异同。结果:眼外肌卫星细胞与骨骼肌卫星细胞在体外生长和增殖的过程中形态学变化一致:肌纤维种植后第1天起大量析出,1周内培养皿内呈小梭形细胞样贴壁、迅速增殖并呈相互融合趋势,2周后肌纤维旁赘生大细胞团和细胞团外放射状的肌管形成（表现为新生型肌球蛋白重链的染色阳性）,并形成三维的网状结构（表现为α-平滑肌肌动蛋白染色阳性）。两种细胞的免疫荧光染色:结蛋白、肌生成素α-平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白轻链均表达阳性;眼外肌特异性肌球蛋白抗体的染色结果,在眼外肌卫星细胞表达阳性而骨骼肌卫星细胞表达阴性。结论:眼外肌卫星细胞可用酶消化法成功提取,其细胞生长的形态学特点与免疫荧光特性与骨骼肌卫星细胞一致。这两种肌源性干细胞都具有体外增殖并向成肌方向定向分化的能力。第二章机械性损伤兔眼外肌动物模型的建立和自体成体干细胞移植对模型动物的治疗目的:建立机械性损伤大白兔眼外肌的动物模型,观察眼外肌自然修复规律;用自体成体干细胞移植治疗模型动物,观察治疗后眼外肌的修复规律。方法:用割裂法建立眼外肌机械性损伤模型,取肌肉标本行冰冻切片后给予Masson染色、影像学定量（ImageProPlus软件）,观察切片中肌肉组织含量（muscle,M）、胶原含量（collagen,C）、非胶原含量（non-collagen,NC）及细胞核数量（nuclei,N）等指标的变化。体外分离扩增骨髓间充质干细胞（简称骨髓干细胞）。将自体骨髓干细胞和肌卫星细胞用CM-DiI（长效细胞示踪剂）标记并移植到受伤区域,观察外源性供体细胞注入眼外肌组织后的转归及组织相容性。随后用同样两种细胞移植于受伤1周的模型动物,设立移植组2组（两种干细胞移植）和对照组3组（阳性对照组、阴性对照1组和阴性对照2组）等5组,分析各组目标肌肉的组织学变化,对M、C、NC、N等指标进行统计学分析。结果:眼外肌机械性受损后初期以胶原组织增生为特点,1周后纤维化程度逐渐加重:2周时广泛纤维化和疤痕形成,细胞核数量也达到高峰,纤维化进行性加重。CM-DiI标记的移植细胞在体内存留至少14天:第1天即与受体组织相融合,第14天注射区域大片肌纤维着染。各时间点各组肌肉组织含量相对恒定。移植组与阳性对照组相比,后者胶原和非胶原组织含量明显增加,有统计学差异P＜0.05。移植组与阴性对照组间没有统计学差异P＞0.05。5组术后两周胶原与非胶原组织的增生与前期比均达到高峰,有明显统计学差异P＜0.05。细胞核数量表现波动,在移植后第7天为低值,第3和第14天均为高值。骨髓干细胞移植和肌卫星细胞移植对眼外肌修复过程的影响没有统计学差异P＞0.05。结论:机械性眼外肌损伤导致肌肉及周围结缔组织的退行性变、纤维化和疤痕形成。骨髓间充质干细胞和骨骼肌卫星细胞移植到眼外肌微环境后均有很好的局部组织相容性,且能明显减轻机械性损伤导致的肌肉退形性变,促进再生和抗纤维化的修复过程。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文对照及缩写
• 前言
• 第一章 肌肉卫星细胞的体外分离、原代培养和免疫荧光特性
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物
• 1.1.2 主要试剂和药品
• 1.1.3 主要仪器、器械
• 1.1.4 电脑操作系统及主要图像分析软件
• 1.2 研究方法
• 1.2.1 体外分离培养肌肉卫星细胞
• 1.2.2 细胞免疫荧光法定性
• 1.2.3 图像分析与处理
• 1.3 结果
• 1.3.1 卫星细胞体外生长增殖的特点
• 1.3.2 三种细胞的5种免疫荧光蛋白定性的比较性分析
• 1.4 讨论
• 1.5 小结
• 第二章 机械性损伤兔眼外肌动物模型的建立和成体干细胞移植对模型动物的治疗
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 主要试剂和药品
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 电脑操作系统及图像统计分析软件
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 眼外肌机械性损伤动物模型的建立
• 2.2.2 成体干细胞的体外荧光标记、细胞移植和体内追踪
• 2.2.3 干细胞移植治疗眼外肌损伤
• 2.2.4 冰冻切片的组织学染色:Masson's三色法
• 2.2.5 图像参数、处理和分析
• 2.2.6 统计学方法
• 2.3 结果
• 2.3.1 眼外肌纤维化的定量分析
• 2.3.2 CM-DiI示踪供体细胞的转归
• 2.3.3 成体干细胞移植对眼外肌损伤修复过程的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间的主要研究成果