产壳聚糖酶菌株的选育及产酶发酵工艺研究

论文摘要

通过富集培养，初筛，复筛，粘度快速测定以及薄层层析（TLC）分析，从自然界中分离到3株产内切壳聚糖酶活力较高的菌株。经形态、生理生化特征鉴定以及16S rDNA序列分析，3株均归属于Mitsuaria sp．，分别命名为013、和281。其中，Mitsuaria sp．141的产酶能力最强。以Mitsuaria sp．141为出发菌株，先后进行紫外诱变和60Co-γ射线诱变，选育到菌株Mitsuaria sp．141-2，其壳聚糖酶活力提高了30.01％。连续传5代，每代测定酶活力，结果表明，该菌株具有较好的遗传稳定性。通过单因素试验和多因素试验对Mitsuaria sp．141-2发酵进行了研究，得到了优化的产酶工艺：可溶性壳聚糖0.50％、装液量100 mL（500 mL三角瓶）、起始pH值7.0、接种量2％、温度30℃、摇床转速180 r／min、培养时间48 h，在此条件下，酶活力达3.631 U／mL。在10 L容量的发酵罐中扩大培养，装液量7 L、通气量1 vvm、搅拌速率200 r／min、温度30℃，培养36 h壳聚糖酶活力达最高值3.258 U／mL。TLC分析表明，壳聚糖的酶解产物中有壳二糖或其它壳寡糖存在。用乙酰丙酮法测定产物壳聚糖的数均分子量，结果表明，1.5％的壳聚糖胶体溶液与粗酶液体积比15：1，37℃、作用30 min，产物数均分子量降到10921。保持作用条件不变，改变体积比为10：1、5：1、2：1、1：1和1：2，产物的数均分子量逐渐变小，分别为5683、3018、1247、779和747。通过硫酸铵沉淀、离心超滤和Sephadex G-200凝胶柱层析，初步纯化了Mitsuaria sp．141-2壳聚糖酶，该酶为诱导酶，分子量33.6 kD，最适作用pH值为4.0，最适作用温度为37℃～42℃，在45℃以下、pH4.0～pH8.0的环境中较稳定。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 壳聚糖概述
• 1.2 壳聚糖的应用
• 1.2.1 在医药卫生方面的应用
• 1.2.2 在食品工业上的应用
• 1.2.3 在饲料工业上的应用
• 1.2.4 在化学工业上的应用
• 1.3 壳寡糖的制备
• 1.3.1 酸水解法
• 1.3.2 氧化法
• 1.3.3 酶解法
• 1.4 壳聚糖酶研究进展
• 1.4.1 产壳聚糖酶微生物的来源
• 1.4.2 壳聚糖酶的理化性质
• 1.4.3 壳聚糖酶的特征及分类
• 1.5 本课题研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验菌株
• 2.1.2 壳聚糖
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 壳聚糖重要物理性质的测定
• 2.2.2 菌种的筛选
• 2.2.3 菌株的鉴定
• 2.2.4 菌株的诱变
• 2.2.5 菌株生长及产酶特性研究
• 2.2.6 产壳聚糖酶发酵工艺研究
• 2.2.7 壳聚糖的酶解产物的初步分析
• 2.2.8 壳聚糖酶的分离与纯化
• 2.2.9 壳聚糖酶的酶学性质研究
• 3 结果与分析
• 3.1 壳聚糖重要物理性质的测定
• 3.1.1 表观粘度的测定
• 3.1.2 粘均分子量的测定
• 3.2 菌种筛选
• 3.2.1 初筛结果
• 3.2.2 复筛测定酶活力结果
• 3.2.3 氨基葡萄糖标准曲线
• 3.2.4 乌氏粘度计测定壳聚糖胶体溶液酶解前后粘度变化
• 3.2.5 薄层层析（TLC）分析
• 3.3 菌株鉴定结果
• 3.3.1 形态特征鉴定
• 3.3.2 生理生化特征鉴定
• 3.3.3 16S rDNA序列分析
• 3.4 菌株的诱变
• 3.4.1 紫外（UV）诱变
• 60Co-γ射线诱变'>3.4.2⁶⁰Co-γ射线诱变
• 2.4.3 突变菌株的遗传稳定性检测
• 3.5 菌株生长及产酶特性研究结果
• 3.5.1 生长曲线
• 3.5.2 产壳聚糖酶的分泌性
• 3.5.3 产壳聚糖酶的诱导性
• 3.6 产壳聚糖酶发酵工艺研究
• 3.6.1 不同壳聚糖对产酶的影响
• 3.6.2 接种量对产酶的影响
• 3.6.3 培养温度对产酶的影响
• 3.6.4 摇瓶装液量对产酶的影响
• 3.6.5 壳聚糖浓度对产酶的影响
• 3.6.6 培养基起始pH值对产酶的影响
• 3.6.7 四因素三水平正交实验
• 3.6.8 10L发酵罐发酵产酶研究
• 3.7 壳聚糖的酶解产物初步分析
• 3.7.1 TLC分析
• 3.7.2 酶解产物数均分子量的测定
• 3.8 壳聚糖酶的分离与纯化
• 4）₂SO₄分级盐析'>3.8.1 （NH₄）₂SO₄分级盐析
• 3.8.2 Sephadex G-200柱层析初步纯化壳聚糖酶
• 3.8.3 SDS-PAGE凝胶电泳
• 3.9 壳聚糖酶的酶学性质研究
• 3.9.1 壳聚糖酶的最适作用pH值
• 3.9.2 壳聚糖酶的最适作用温度
• 3.9.3 壳聚糖酶的酸碱稳定性
• 3.9.4 壳聚糖酶的温度稳定性
• 4 小结与讨论
• 4.1 壳聚糖酶产生菌的筛选
• 4.2 壳聚糖酶产生菌的鉴定
• 4.3 壳聚糖酶产生菌的诱变
• 4.4 Mitsuaria sp.141-2的产酶发酵工艺研究
• 4.5 壳聚糖的酶解产物的初步分析
• 4.6 壳聚糖酶的分离纯化及酶学性质研究
• 参考文献
• 致谢