立体选择性脂肪酶在手性化合物拆分中的应用基础研究

论文摘要

有机分子的立体化学决定了其生物活性,立体选择性己成为催化领域的一个关键因素。生物催化具有反应条件温和、选择性高、副反应少和环境污染小等优点,不仅具有重要的学术研究价值,而且还具有良好的应用价值。本文对立体选择性脂肪酶高产菌的筛选、微生物脂肪酶的液态发酵、脂肪酶的固定化及固定化酶的酶学性质、外消旋烯丙醇酮和2-辛醇的酶法拆分、非水相中酶立体选择性的调控、酶促拆分反应动力学以及固定化酶的反应器等进行了研究。采用Rodamine B/酯同化平板定向筛选法,构建了立体选择性脂肪酶及其产生菌的定向筛选新体系。从实验室已有的脂肪酶产生菌中,筛选确定Alcaligenes sp和Penicillium expansum PED-03为立体选择性催化拆分（R,S）-烯丙醇酮的脂肪酶产生菌;P.expansum PED-03为拆分（R,S）-2-辛醇的脂肪酶产生菌。试验结果表明,采用这种定向筛选体系筛选得到的菌株所产的脂肪酶具有良好的立体选择性。对P.expansum PED-03液态发酵产脂肪酶的工艺参数进行了优化,脂肪酶活力高达850U/mL。酶学性质研究结果表明:P.expansum PED-03脂肪酶（PEL）属于碱性脂肪酶。其最适pH值为9.5,在pH6.0～10.0的范围内具有明显的催化活力。以改性Ultrastable-Y分子筛为脂肪酶的固定化载体,建立了脂肪酶固定化的新方法。PEL被改性Ultrastable-Y分子筛固定化后的适宜反应温度和pH值范围更宽;对游离PEL有强烈抑制作用的金属离子,如Fe3+,Cu2+和Mn2+等,对固定化PEL的催化活性表现出不同程度的促进作用。与其它固定化载体相比,以改性Ultrastable-Y分子筛固定的PEL操作性能稳定、其贮存稳定性也得到了明显提高。这种固定化方法不仅可抑制酶的泄漏、克服游离酶在非水相中易结块且分散性差的弊端,还能维持脂肪酶在非水体系中发挥活性所需的微环境,从而大大提高脂肪酶的催化性能。所制备的固定化脂肪酶不结块,可重复回收利用,操作方便,具有良好的工业化应用价值。采用固定化PEL对外消旋烯丙醇酮进行酶法拆分,确立了底物浓度、酶用量、反应温度、体系pH值和摇床转速分别为0.12g/mL、200U/g、35℃、pH9.5和200r/min。在此条件下,反应36h左右底物转化率接近50%,eep可达99%以上;对外消旋烯丙醇酮乙酸酯酶法-化学转化耦联拆分进行了研究,发现磺化剂、有机介质、碱性添加剂、磺化温度对磺化反应有重要影响,磺化剂、有机介质、碱性添加剂分别以苯磺酰氯、二氯甲烷、三乙胺为宜,磺化温度以20℃为宜。三乙胺的添加方式对磺化反应也有着重要影响,以滴加方式添加为宜。利用固定化PEL在微水体系中拆分（R,S）-2-辛醇,研究结果表明:介质类型、“记忆”pH值和反应体系的含水量对固定化PEL酶促拆分（R,S）-2-辛醇有较大影响。在以正己烷为溶剂、“记忆”pH值为9.5、含水量为0.8%的体系中,50℃反应24h,转化率（c）可达理论值的97.68%,对映体过量值（ee）达98.75%。连续8批反应的eep值均稳定在98%以上。低浓度的非离子表面活性剂如Tween-80等对酶促拆分反应的立体选择性有改善作用,但当添加量过高时,立体选择性反而会下降。在研究Ultrastable-Y分子筛固定化对金属离子作用的影响的过程中,提出了非水相中酶催化的“条件激活”假说:酶的活性中心存在一个“活性中心盖”,而且这个“活性中心盖”可以随酶分子微环境的改变而呈“开”或“合”的状态。当由于金属离子/盐外部加入或其它因素的条件改变而导致酶分子微环境发生有利改变

论文目录

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第一章文献综述

1.1 微生物脂肪酶的研究进展

1.1.1 产脂肪酶的微生物

1.1.2 脂肪酶产生菌的筛选方法

1.1.3 脂肪酶的测定方法

1.1.4 微生物脂肪酶的发酵生产

1.1.5 脂肪酶的理化特性

1.1.6 脂肪酶的催化特性

1.1.7 脂肪酶的固定化

1.1.8 脂肪酶的主要应用领域

1.2 手性拆分的研究进展

1.2.1 拆分方法的研究进展

1.2.2 拆分体系的研究进展

1.2.3 酶法拆分的原理

1.2.4 酶立体选择性调控的研究进展

1.3.本文的研究思路与主要内容

第二章立体选择性脂肪酶高产菌株的筛选

2.1 材料与方法

2.1.1 菌种

2.1.2 培养基

2.1.3 染色液

2.1.4 种子培养

2.1.5 摇瓶产酶

2.1.6 脂肪酶活力测定

2.1.7 外消旋烯丙醇酮醋酸酯的制备

2.1.8 外消旋2-辛醇醋酸酯的制备

2.1.9 立体选择性脂肪酶高产菌的筛选

2.1.10 菌株形态观察

2.1.11 生物学特性研究

2.2 实验结果与讨论

2.2.1 立体选择性脂肪酶高产菌株的筛选

2.2.2 筛选得到的产脂肪酶菌株的生物学特性

2.3 小结

第三章 P.expansum PED-03液体发酵产脂肪酶及酶学性质研究

3.1 材料与方法

3.1.1 菌种

3.1.2 主要试剂

3.1.3 培养基

3.1.4 种子培养

3.1.5 摇瓶产酶

3.1.6 发酵罐产酶

3.1.7 脂肪酶活力测定

3.2 结果与讨论

3.2.1 影响产酶的主要因素

3.2.2 酶学性质研究

3.3 小结

第四章 PEL的固定化及固定化PEL的酶学性质研究

4.1 材料与方法

4.1.1 实验材料

4.1.2 PEL的提取

4.1.3 Ultrastable-Y分子筛的改性

4.1.4 pH9.5的缓冲液的配制

4.1.5 改性Ultrastable-Y型分子筛固定化脂肪酶的制备

4.1.6 海藻酸钠（SA）固定化脂肪酶的制备

4.1.7 硅藻土、大孔树脂、硅胶、碳酸钙固定化脂肪酶的制备

4.1.8 pH梯度溶液的配制

4.1.9 固定化酶的活力测定

4.1.10 固定化酶最适温度

4.1.11 固定化酶的热稳定性

4.1.12 固定化酶最适pH值

4.1.13 固定化酶的pH稳定性

4.1.14 金属离子对固定化酶活性的影响

4.1.15 固定化酶的操作稳定性

4.1.16 固定化酶的贮存稳定性

4.2 结果与讨论

4.2.1 固定化载体的选择

4.2.2 固定化条件的优化

4.2.3 固定化PEL的酶学性质研究

4.2.4 操作稳定性

4.2.5 贮存稳定性

4.3 小结

第五章固定化PEL拆分外消旋烯丙醇酮的研究

5.1 材料与方法

5.1.1 主要试剂

5.1.2 缓冲液的配制

5.1.3 外消旋烯丙醇酮乙酸酯的制备

5.1.4 外消旋烯丙醇酮乙酸酯的酶促水解

5.1.5 （R）-烯丙醇酮磺化

5.1.6 磺化（R）-烯丙醇酮酯水解

5.1.7 （S）-烯丙醇酮酯乙酸酯的化学水解

5.1.8 脂肪酶活力测定

5.1.9 对映体过量值（ee）和底物转化率（C）及对映体选率（E）的测定

5.2 结果与讨论

5.2.1 外消旋烯丙醇乙酸酯的酶促水解

5.2.2 酶法-化学转化耦联拆分

5.3 小结

第六章固定化PEL拆分（R，S）-2-辛醇的研究

6.1 材料与方法

6.1.1 材料

6.1.2 方法

6.2 结果与讨论

6.2.1 不同载体固定化PEL在非水相中催化性能的比较

6.2.2 影响非水相中固定化PEL催化性能的因素

6.2.2 Ultrastable-Y分子筛固定化对PEL在非水相中的酶学性质的影响

6.2.3 拆分进程曲线

6.2.4 利用改性Ultrastable-Y分子筛固定化PEL重复分批拆分（R，S）-2-辛醇

6.3 小结

第七章非水相中脂肪酶立体选择性的调控

7.1 材料与方法

7.1.1 材料

7.1.2 方法

7.2 结果与讨论

7.2.1 固定化对立体选择性的影响

7.2.2 体系水含量对立体选择性的影响

7.2.3 温度对立体选择性的影响

7.2.4 “记忆”pH值对立体选择性的影响

7.2.5 有机介质对立体选择性的影响

7.2.6 酰基供体对立体选择性的影响

7.2.7 添加剂对立体选择性的影响

7.3 小结

第八章非水相中固定化PEL拆分外消旋2-辛醇的动力学研究

8.1.酶反应速度方程的推导方法

8.2.多底物酶促反应历程的Cleland表示法

8.3.PEL催化拆分（R，S）-2-辛醇的机理

8.4.PEL手性拆分（R，S）-2-辛醇反应的动力学模型的推导

8.5.动力学模型参数的拟合

8.6.模型动力学参数的直接求解

8.7.小结

第九章非水相中固定化PEL拆分（R，S）-2-辛醇的反应器研究

9.1.材料与方法

9.1.1 材料

9.1.2 方法

9.1.3 分析方法

9.2.结果与讨论

9.2.1 BSTR中改性Ultrastable-Y分子筛固定化PEL对（R，S）-2-辛醇的拆分

9.2.2 CSTR中改性Ultrastable-Y分子筛固定化PEL对（R，S）-2-辛醇的拆分

9.2.3 PBR中改性Ultrastable-Y分子筛固定化PEL对（R，S）-2-辛醇的拆分

9.2.4 三种反应器的评价与选择

9.3.小结

第十章结论与建议

10.1.结论

10.2.建议

参考文献

附录

致谢

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